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vale tlb
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 Inserito il - 18 giugno 2007 : 16:21:05
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ciao... venerdi ho lìesame di diagnostica molecolare.. qualcuno potrebbe spiegarmi in modo abba riassuntivo.. giusto 3 cose della dgge e ttge???? grazie mille
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vale tlb |
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Iside
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1375 Messaggi |
 Inserito il - 18 giugno 2007 : 18:34:04
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DGGE: denaturing gel gradient electrophoresis
é una tecnica mutation scanning usata per l'identificazione di mutazioni note su un dsDNA. Se è presente la mutazione in eterozigosi, facendo denaturare e rinaturare i filamenti otterrai la formazione di omoduplex ed eteroduplex. (Se la mutazione è in omozigosi la tecnica la puoi fare lo stesso, ma in quel caso occorre miscelare un DNA controllo con il tuo paziente, altrimenti non vedrai mai la formazione degli eteroduplex).
Il principio della separazione è che in un gradiente denaturante (con % crescenti di urea o formaldeide), l'eteoduplex si denatura prima dell'omoduplex, perchè a causa del mismatch si crea una bolla di denaturazione. Quindi su gradiente l'elettroforesi dell'eteroduplex si arresterà prima.
In genere ai filamenti viene applicata una pinza di GC (GC clamps) in modo tale che l'eteroduplex si denaturi ma i due filamenti non si separano mai completamente grazie alla pinza che li tiene uniti.
Per la TGGE vale lo stesso principio, ma in questo caso il gradiente denaturante non è chimico ma termico.
giusto per chiarezza, prova anche a guardare questa immagine:
http://biotech.szbk.u-szeged.hu/CG_Jegyzet/02_ora/abrak/htmlhez/modszerek/dgge1.jpg
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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vale tlb
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6 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2007 : 18:50:25
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 grazie mille...... |
vale tlb |
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vale tlb
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6 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2007 : 19:00:07
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scusami ancora... l'eteroduplex si forma quando siamo in eterozigosi e l'omoduplex in omozigosi??? nell'omoduplex ho 1 picco nell'etero 2 ??? ehehehe spero di nn aver detto tr cazzate,,grazie mille ancora  |
vale tlb |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2007 : 10:11:08
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no, aspetta, non è una questione di picchi, stai facendo un'elettroforesi su gel, quindi alla fine vedi delle bande.
Immagine che la condizione wild type sia A-T
Se hai una mutazione in eterozigosi avrai su un filamento A-T e sull'altro G-C
Se invece hai la mutazione in omozigosi troverai G-C su entrambi i filamenti.
Considera il mutato eterozigote: se fai denaturare e rinaturare i filamenti ottieni 2 omoduplex (A-T e G-C)e due eteroduplex (A-G e C-T). L'eteroduplex non è perfettamente appaiato, perchè normalmente A non si appaia con G e C non si appaia con T, quindi negli eteroduplex in corrispondenza del misappaiamento si forma una bolla. Questa bolla renderà instabile i dsDNA, di modo che facendoli correre su un gradiente denaturante i filamenti con la bolla, avendo meno densità di carica, si separano prima.
Nell'omoduplez invece la condizione è che hai C-G su entrambi i filamenti. Se fai denaturare e rinaturare non ti cambia nulla, perchè si formeranno sempre e solo filamenti con C-G (quindi solo omoduplex)!!! Quindi hai bisogno di far formare anche gli eteroduplex. Il modo più semplice per farlo è miscelare il DNA che stai saggiando con un controllo, quindi un campione di DNA in cui sai che non c'è la mutazione. Quindi varai il campione ch eporta la mutazione in C-G e un wild type che invece è A-T. In questo modo è come se tu avessi ricreato la situazione dell'eterozigote.
Ho trovato quest'altra immagine che potrebbeb aiutarti a cpire bene la formazione degli omo ed eteroduplex:
http://www.molecularlab.it/public/data/GFPina/200718193959_heteroduplex%20e%20homoduplex.jpg
Chiedi pure se ci sono problemi.
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vale tlb
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6 Messaggi |
 Inserito il - 19 giugno 2007 : 10:18:55
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| ehh oh adesso sembra essermi tutto molto piu chiaro!!!!!grazie mille davvero!!!! poi ti sapro' dire come e' andato l'esame!! |
vale tlb |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2007 : 10:24:48
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in bocca al lupo  |
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vale tlb
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: maranello
6 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2007 : 10:29:16
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| crepiiiiii tantissimo!!! anche perche venerdi oltre a questo ho anche quello di patologia molecolare e tutto in 2 ore quindi!!!! |
vale tlb |
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