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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
 Inserito il - 30 novembre 2009 : 22:15:44
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Sono nella fase della prima analisi dei dati della Real Time Pcr. Ho letto un po' di tutto sul forum ma ho ancora qualche domanda senza risposta:
1) Cosa si intende per Cycle range? Ho visto che quando lo modifico varia anche la Threshold...
2) Ho letto che la Threshold va settata a 10 DS standard superiore alla baseline...ma sul mio programma non c'è una voce "baseline"...Ma posso settare 10x DS del Cycle range...quindi suppongo sia la stessa cosa...ma perchè proprio 10? e non 9?
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2009 : 23:06:08
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Un po' velocemente, non ho molto tempo.
Il cycle range è in realtà il "baseline cycle range" cioè il range di cicli a cui imposti la baseline (il tuo background) perché il segnale sia significativo deve essere abbastanza sopra al background (da qui le 10 deviazioni standard)
Per il DDCt sarebbe:
DCt = Ct (GOI) - Ct (HKG)
DDCt= DCt(sample) - DCt(Reference)
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2009 : 20:29:44
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Grazie per le risposte!
Altre domande
Citazione:
DCt = Ct (GOI) - Ct (HKG)
DDCt= DCt(sample) - DCt(Reference)
Ma visto che si lavora in doppi o triplicati, non è meglio fare:
DCt = Ct (GOI) - media Ct (HKG)?
e
DDCt= DCt(sample) - media DCt(Reference)?
Citazione:
Il 10 è assolutamente arbitrario. Il threshold lo puoi benissimo settare "a occhio"
Ma come a occhio?!?!
P.S. oggi ci hanno aggiornato il software della biorad, quindi ora fa tutto lui...dal setting del threshold al calcolo del DDct e DS...
Quindi le domande le faccio per puro spirito di conoscenza |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2009 : 02:11:53
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ok ok ho capito vuoi solo complicarci la vita! 
Non ti puoi accontentare delle risposte che ti abbiamo dato??? 
Va bene, vediamo se riesco a soddisfare la tua curiosità:
Citazione:
Il 10 è assolutamente arbitrario. Il threshold lo puoi benissimo settare "a occhio"
Citazione:
Ma come a occhio?!?!
Come dicevo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=14676 (e forse anche in altre discussioni)
il 10 come dice Nico è un valore arbitrario, ma sufficientemente alto per essere abbastanza al di sopra del rumore di fondo (background).
Il senso è: devi fare le tue misurazioni (quindi mettere la soglia) in una zona in cui il segnale sia dovuto solo dal tuo amplificato (quindi lontano dal background) e dove la reazione sia in fase esponenziale (altrimenti non c'è linearità tra numero di cicli e quantità di amplificato prodotto - duplicazione ad ogni ciclo)
guarda ad es. qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12550
Citazione:
Ma visto che si lavora in doppi o triplicati, non è meglio fare:
DCt = Ct (GOI) - media Ct (HKG)?
e
DDCt= DCt(sample) - media DCt(Reference)?
magari sarebbe:
DCt = media Ct (GOI) - media Ct (HKG)
e
DDCt= DCt(sample) - media DCt(Reference)
spero sia chiara questa correzione! (altrimenti ok... chiedi)
Il senso di fare i campioni in duplicato o meglio in triplicato comunque, più che per fare a media (che per carità è giustissimo, ma che se hai fatto le cose per bene ti devono venire molto simili!) è quello che verificare che non ci siano errori, se hai ad es questi 3 Ct nei tuoi 3 replicati:
19,1 19,8 25,2
ovviamente è successo qualcosa nel terzo pozzetto e devi scartare quel dato, se fai la media dei 3 replicati è sbagliato.
Questo è anche il motivo per cui meglio fare 3 replicati, perchè con 2 se hai valori discordanti, non sai quale dare per buono.
Citazione:
P.S. oggi ci hanno aggiornato il software della biorad, quindi ora fa tutto lui...dal setting del threshold al calcolo del DDct e DS...
Quindi le domande le faccio per puro spirito di conoscenza
Beh scherzi a parte è sempre giusto sapere queste cose, è vero che i programmi fanno tutto in automatico (anche il mio! Di certo non mi sono mai messa a calcolare le 10 DS! ) però i programmi possono sbagliare ed è giusto sapere cosa fare.
Io faccio fare l'analisi al programma, ma comunque controllo che sia tutto corretto, a volte mi ha messo delle soglie allucinanti! Bisogna sapere come intervenire in quei casi.
Piccola curiosità personale, che programma avete? (e quale avevate prima?) io ne ho 2 MyIQ 1.0 che è quello per far funzionare la macchina e iQ5 2.0 per analizzare i risultati. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2009 : 09:23:42
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Citazione:
ok ok ho capito vuoi solo complicarci la vita!
Non ti puoi accontentare delle risposte che ti abbiamo dato???
ahiahiahi...
Ok, ora mi è tutto chiaro!!! Grazie per le spiegazioni !!!
Riguardo i software prima avevamo Opticon Monitor 3, ora invece ci hanno installato CFX Manager Software con cui funziani la macchina e fa anche le analisi...Suppongo abbiamo real-time diverse, no?! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2009 : 10:16:48
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Citazione:
Come dicevo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=14676 (e forse anche in altre discussioni)
il 10 come dice Nico è un valore arbitrario, ma sufficientemente alto per essere abbastanza al di sopra del rumore di fondo (background).
Il senso è: devi fare le tue misurazioni (quindi mettere la soglia) in una zona in cui il segnale sia dovuto solo dal tuo amplificato (quindi lontano dal background) e dove la reazione sia in fase esponenziale (altrimenti non c'è linearità tra numero di cicli e quantità di amplificato prodotto - duplicazione ad ogni ciclo)
guarda ad es. qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12550
Dai, io sono stato un po' più stringato e ho detto "a occhio" |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2009 : 16:55:56
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Dai, io sono stato un po' più stringato e ho detto "a occhio"
Eeeee ma qualcuno non si accontenta! 
Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Suppongo abbiamo real-time diverse, no?!
mmm mi sa di si!
che peccato non ti potrò dare supporto tecnico direttamente sul programma ( ) |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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molly83
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2010 : 11:50:07
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Salve a tutti mi sono appena iscritta al forum sperando di trovare un chiarimento o magari la soluzione al mio problema.Al momento in lab stiamo studiando l'espressione di un marcatore tumorale, utiliziamo sonda taqman marcata in joe e mix cn ung, il problema è questo abbiamo fatto la curva standar per la quantificazione assoluta utilizzando un plasmide (fornito dalla ditta già con inserito il nostro amplificato di interesse)abbiamo linearizzato e quantificato il plasmide tramite nanodrop, fatto diluizioni successive solo che al momento della real time non abbiamo risultati uguali, nel senso che facendo la curva anche a due ore di distanza con le stesse diluizioni otteniamo cicli differenti. Inoltre in una prova abbiamo messo lo standard ed i campioni per provare una quantificazione...ebbene nonostante sia stato usato lo stesso protocollo i campioni uscivano a cicli diversi in corse eseguite in giorni differenti, si parla di differenze anche di 8 cicli. come è possibile? utilizziamo il rotor gene 3000.
Grazie! |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2010 : 13:11:08
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| mmm non è che la macchina è rotta? non la conosco ma dovrebbe avere dei tool di diagnostica |
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molly83
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2010 : 11:06:03
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Provo a vedere...purtroppo il software non è così intuitivo. 
Grazie cmq! :) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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Didattica e Relazioni
