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caty_85
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
4 Messaggi |
 Inserito il - 01 ottobre 2007 : 10:58:20
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Ciao a tutti, è la prima volta che scrivo su questo forum, ed hp subito un quesito da porvi. Sto per iniziare il mio tirocinio per la preparazione di una tesi sperimentale. io svilupperò una tesi sulle funzionalità della REAL TIME PCR, in realtà questa tecnica mi è del tutto nuova, so solo che si basa sull'amplificazione del DNA con l'ausilio di fluorofori o sonde che legandosi al Dna ci mostrano in tempo reale l'amplificazione del filamento. Vorrei sapere quali sono le differenze con la PCR classica? Anche nella real time ci sono i cicli e su quali pricinpi si basa la real time.
Grazie mille
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2007 : 11:52:12
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Ciao caty_85,
la real-time PCR è uno strumento molto utile al fine di individuare l'espressione genica all'interno di una popolazione cellulare, in quanto ti dà una stima quantitativa sul contenuto del specifico trascritto che stai studiando. Dopo aver estratto l'RNA dalle cellule, lo si retrotrascrive a cDNA, che viene poi sottoposto a real-time PCR.
La real-time PCR si differenzia dalla PCR classica proprio per il fatto che l'amplificazione del cDNA e il rilevamento dell'amplificato avvengono nello stesso momento utilizzando metodi di fluorescenza, come le sonde Taqman, che sono sonde marcate da fluorocromo, oppure il Sybr green, che è un intercalante del DNA: in questo modo si ottengono delle stime quantitative sull'abbondanza del trascritto nelle cellule, in quanto a maggior segnale corrisponde maggior quantità di trascritto.
Generalmente si utilizzano dei controlli positivi interni, come ad esempio si può amplificare dei housekeeping genes (es. GAPDH, PGK), che essendo costitutivamente espressi avreanno una quantità di trascritto elevato in ciascuna cellula ed usciranno dopo pochi cicli di PCR.
Infatti, il numero di cicli per rendere amplificare un trascritto è abbastanza proporzionale con la quantità di trascritto stesso: un gene che è altamente espresso verrà amplificato in meno cicli rispetto ad un gene che è poco espresso.
Spero di esserti stato un po' utile...
Ciao
Luca |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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caty_85
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
4 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2007 : 17:11:26
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Grazie mille Luca, mi sei stato davvero di grande aiuto! Grazie mille!!! A presto |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 02 ottobre 2007 : 19:19:47
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Anch'io ho fatto la tesi sulla Real Time PCR e a quel che vedo sei anche tu di Bari. Dove la stai facendo?
Se ti interessa ho del materiale! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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caty_85
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
4 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2007 : 14:21:08
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Ciao Luis, io sono iscritta a scienze biosanitarie a Bari e ho chiesto di poter fare il tirocinio esterno e lo sto svolgendo presso l'ospedale IRCSS di Castellana Grotte, tu dove hai fatto il tirocinio? E anche tu sei iscritto a uno dei 3 corsi di biologia a Bari?
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2007 : 15:52:41
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Io sono iscritto a biotecnologie e il tirocinio l'ho fatto al palazzo di Biologia, 5° piano.
Ho capito il tipo di tirocinio che dici, da noi quelli esterni ci sono solo alla specialistica. Nella triennale, il più esterno di tutti all'università e al policlinico, è quello al CNR.
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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myosotis
Nuovo Arrivato
Prov.: Cuneo
2 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2007 : 16:17:30
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Ciao!so di affrontare un argomento che a qualcuno potrà sembrare banale ma sono alcuni giorni che sto impazzendo (e il mio computer con me!)
Devo disegnare dei primer per PCR real time su un tratto genomico (sarebbe ottimale identificare la regione dei primer a cavallo tra l'esone e l'introne). Ho usato blastn per identificare eventuali analogie di tale gene con altri tratti per individuare in tal modo la regione su cui poi disegnare i primer. La ricerca mi crea problemi perchè penso di non essere capace di leggere in modo corretto i risultati (e spero di riuscire a spiegarmi)
Mi vengono fornite le sequenze che presentano similarità con il mio tratto d'interesse(identificato dal numero gi) e sotto ognuna di queste ci sono altre sequenze nucleotidiche introdotte per lo più dalla dicitura seguente
"Features flanking this part of subject sequence:
___ bp at 5' side:______
___ bp at 3' side: ______
Score = 50.0 bits (54), Expect = 0.019
Identities = 45/57 (78%), Gaps = 0/57 (0%)
Strand=Plus/Minus"
i miei dubbi sono:
-tali allineamenti proposti sotto lo stesso numero "gi" son da considerarsi?cossa indicano?
-il mio tratto è di circa 3500pb, le sequenze che presentano un qualche appaiamento sono 169..io ho iniziato a ricopiare le uguaglianze della sequenza l'una sotto l'altra per identificare una qualchhe regione per il disegno dei primer...c'è un qualche metodo più veloce ed efficace per identificare la regione che non appaia con altri tratti genomici?
spero di non aver fatto troppa confusione nella spiegazione del mio problema e vi ringrazio pr l'attenzione e per eventuali delucidazioni.
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caty_85
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
4 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2007 : 17:19:51
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Si ho molti amici iscirtti a bioteconologie e mi hanno appunto parlato di questo CNR!C'è una mia amica che ha fatto il tirocinio al 5° piano di biologia che studia biotecnologie, si chiama Roberta, (non ricordo il cognome) è di Taranto, la conosci?
Comunque ti sarei davvero grata se mi passassi qualcosa sulla PCR real time, grazie mille!
A presto Luis e grazie in anticipo
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2007 : 18:27:56
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No, non la conosco! Bisogna vedere di che anno è, io quest'anno devo fare il secondo anno alla specialistica.
Comunque, mandami un messaggio privato col tuo indirizzo email o di MSN messenger e così ti mando quello che ho. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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danich
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2008 : 10:10:15
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Ciao ragazzi sono nuovo di questo forum, però vedo che ci sono tutte persone preparate e che hanno voglia di imparare e condividere le proprie esperienze. Anch'io stò per cimentarmi in una tesi specialistica basata sulla Real-Time PCR se qualkuno mi può dare qualke info o un pò di materiale mi farebbe un grosso piacere.
Aspetto vostre notizie |
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Real time PCR
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