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nima
Nuovo Arrivato
Città: catania
4 Messaggi |
 Inserito il - 22 dicembre 2005 : 11:20:48
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ciao a tutti sono nima, devo iniziare un proggetto che prevede l'utilizzo della real time pcr...il problema è che non ho mai avuto a ke fare con la real time!!!! qualcuno mi può aiutare?????
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maria |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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nima
Nuovo Arrivato
Città: catania
4 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2005 : 11:31:03
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| sulla teoria so qualcosa...ma non so come applicarla...sono ancora alle prime armi nonstante la mia età... |
maria |
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nima
Nuovo Arrivato
Città: catania
4 Messaggi |
 Inserito il - 22 dicembre 2005 : 11:34:32
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| cmq sarebbe gradito...un consiglio pratico!!!! |
maria |
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nima
Nuovo Arrivato
Città: catania
4 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2005 : 11:38:19
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| ci 6? |
maria |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2005 : 13:00:47
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La real-time e' una PCR "avanzata" che ti permette di amplificare anche piccole quantita' di DNA e soprattutto e' quantitativa.
La tecnica e' basata sull'uso di sonde fluorescenti o di intercalanti (sempre fluorescenti) che permettono di determinare la presenza del gene che stai amplificando.
Esistono essenzialmente 2 metodi principali di fare real-time (poi esistono tutta una serie di variazioni sul tema e ne escono di nuove ogni giorno...):
1) Sonde Taqman. Hai 2 primer, come in una PCR normale, piu' una sonda marcata con un fluoroforo ed un quencher che si lega vicino al primer sul 5'. Quando la Taq polimerizza va a smangiare la sonda, allontanando il fluoroforo dal quencher e cosi' aumentando la fluorescenza.
2) SYBR Green (o altri intercalanti simili) che emettono quando intercalati a DNAds. Quindi piu amplifichi piu fluorescenza vedi.
Conta che il metodo 2 e' piu aspecifico, quindi devi essere sicura di avere primer molto buoni. Il metodo 1 e' migliore a mio parere.
La real-time e' moooolto sensibile, e benche' questo sia un vantaggio comporta una facilita' di inquinamento dei campioni piuttosto alta. I primi consigli pratici che ti darei sono:
1) lavorare possibilmente in un ambiente dove si fa solo quello (se si puo' adibire una stanza alla realtime e' ottimo)
2) caricare sempre i campioni in duplicato o triplicato in modo che se uno "sballa" lo puoi scartare e hai comunque il suo duplicato.
3) pipettare con molta accortezza, evitando di far formare bolle nelle provette (o nelle multiwell se usi quelle) perche' possono sensibilmente alterare la lettura, soprattutto se sono sul fondo.
4) se usi taqman puoi fare pcr multiplex x amplificare piu di un gene nella stessa provetta. Non farlo mai x piu' di 3 geni, diventa poco attendibile.
5) il metodo e' molto sensibile, ma prendi con le pinze amplificazioni oltre il 40esimo ciclo.
Questi sono consigli di base... se vuoi sapere qualcosa di piu preciso chiedi pure!
nICO
PS: Guarda anche http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=111
PPS: Conta che questo e' un forum non una chat, quindi magari devi aspettare un po' per le risposte...  |
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alebe
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 gennaio 2006 : 16:03:29
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ciao a tutti sono alessia, ho iniziato circa un mese fa ad utilizzare la real time per la detection di OGM in mangimi, ho ordinato primer e probe già disegnate e ho messo a punto la simplex, so che è possibile effettuare delle multiplex, ma non riesco a trovare un protocollo che spieghi nei dettagli la metodica.
Sicuramente qualcuno di voi è in grado di aiutarmi....CI CONTO!!!
Grazie mille |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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real time pcr....
Didattica e Relazioni
