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carlo4567
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
40 Messaggi |
 Inserito il - 11 ottobre 2006 : 11:08:38
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Mi é stato chiesto di fare un modello tramite la procedura di homology modelling di una proteina X.
Sono partito facendo un psi-blast ed ho selezionato la prima entry trovato con l'icona S (cioè che avesse già un modello pdb), che chiamerò target
A questo punto ho salvato in un file di testo l'allineamento della proteina X con quella del target.(allineamento 1)
Ho selezionato 25 sequenze casuali (compreso la proteina X e la sequnza target), derivate dall'operazione di blast ed ho eseguito un multiallineamento con ClustalW.
Dal file di multiallineamento ho eliminato tutte le sequenze tranne la proteina X e la target. Tutta questa operazione per ottimizzare la procedura di allineamento tra target e proteina X. Infatti ho confrontato questo file con questo file con l'allineamento 1 per rilevare eventuali delezioni o inserzioni.
Successivamente in swiss pdb viewer ho usato queste informazioni per editare l'allineamneto tra il file pdb ed il file di sequenza.
E' giusta questa procedura?
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 12:56:05
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Ciao,
secondo me ci son vari errori:
1- prendere la prima proteina fornita da blast con struttura nota non è sufficiente, devi controllare se esiste una qualche omologia (in poche parole cerchi una relazione evolutiva e/o funzionale) fra la proteina X e la proteina target.
2- perchè 25 sequenze casuali? secondo me questo passaggio con ClustaW è proprio sbagliato. L'ottimizzazione dell'allineamento non si fa certo tramite 1 allineamento multiplo con 25 sequenze...anzi in questo modo rischi di avere fra le 25 sequenze 1 sequenza che ha 1 frammento non conservato che ti fa slittare tutto l'allineamento inserendo gap che poi in realtà non esistono fra la tua proteina X e la proteina target. Ripeto questa procedura nn l'ho mai sentita fare e per esperienza ti assicuro che è sbaglaita, specialmente se usata con lo scopo con cui la usi te.
3- ti consiglio, dopo blast, di andare direttamente sul PDB e cercare la struttura della proteina target. Mi è successo spesso di trovare proteine che avevano nella struttura una sequenza diversa da quella depositata su altri data base a cui attinge blast...morale l'allineamento di blast spesso non corrisponde all'allineamento da editare in DeepViewer. Quello che si fa solitamente è prendere la struttura, caricarla su DeepViewer e salvare la sequenza della struttura in formato fasta. A questo punto con questa sequenza fai un allineamento binario con la proteina X. Questo allineamento lo usi poi per editare l'allineamento su DeepViewer!
Spero tu abbia capito...temo di nn essermi spiegato un gran che bene!
ciao ciao  |
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carlo4567
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
40 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 13:38:24
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Grazie Filippo
Avrei però bisogno di alcuni chiarimenti
1)Prendere la prima proteina, intendevo dire quella con l'e-value più basso, ovvero la prima che si trova a struttura nota, con l'evalue più basso
Mi chiedo però se quella trovata ha un e-value elevato , cosa fare
2)Come si fa da swiss prot a salvare la sequenza in formato fasta?
3) Cosa intendi per allineamneto binario? blast2blast o needle o quale altro?
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 14:11:39
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Allora:
1- Certo, con prima proteina si intende la migliore...quindi e-value minore. Se la prima con struttura nota ha 1 e-value alto molto probabilmnte non è omologa e quindi non ha senzo fare il modelling per omologia. Se per caso è omologa c'è comunque poco da fare, perchè le zone allineate saranno così brevi da essere inutili per fare 1 modello. Quando sei in questa situazione fare modelling per omologia è impossibile. Ci sono anche altri tipi di procedure per fare modelli non per omologia...ma credimi sono veramente poco affidabili. Ci sono però varie scappatoie a questa situazione...ti lascio 2 articoli in cui, in modo diverso, viene aggirato il problema:
http://tinyurl.com/ycbkvl
http://tinyurl.com/ybuyh4
2- Apri DeepViewer, carichi la proteina, poi vai su File -> Save -> Sequence (FASTA)
3- Allineamento binario è il semplice allineamento fra 2 sole proteine...sarebbe 1 ClustaW fra 2 sole proteine...ci sono degli algoritmi dedicati al semplice allineamento fra 2 proteine, preferibili a ClustaW. Io solitamente uso questo:
http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html
ciao ciao |
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Ugo
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Colleferro
29 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 14:23:54
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Forse ho qualcosa che ti può aiutare..la scannerizzo
come posso inviartela?PRaticamente èun esempio di homology modelling usando pdb-viewer e swiss-model |
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carlo4567
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
40 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 16:44:14
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Puoi inviarla alla mia email
Grazie |
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carlo4567
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
40 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2006 : 17:55:20
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Filippo ti ringrazio ancora.
Fin qui tutto OK
Cosa mi consigli di fare adesso per verificare la validità del modello? |
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 09:57:54
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Dunque...la cosa migliore sarebbe farci sopra un minimo di minimizzazione energetica e dinaminca molecolare con GROMACS o AMBER...per perfezionare la struttura...e per fare un minimo di valutazione energetica sulla stabilità. Cmq lavorare con modelli in programmi di MD non è semplice e ci vuole un minimo di esperienza. Sicuramente la cosa migliore è usare il Validation server disponibile su PDB: http://deposit.pdb.org/validate/
Buon lavoro!
ciao ciao |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 11:01:27
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Secondo me non è sufficiente avere a disposizione un PDB per portare avanti uno studio di homology modeling: SE possibile dovresti avere a disposizione un PDB ottenuto da cristallografia a raggi X, con una risoluzione pari o inferiore a 2 angstrom.
A questo punto esistono diversi programmi per fare modelling (io ho usato i moduli di MOE ed Insight, ma sono a pagamento, non so se ne esistano di free). Gromacs ti servira' successivamente, quando avrai a disposizione gia' il modello con tanto di coordinate atomiche.
Una volta che hai fatto l'allineamento con clustal-W (io personalmente preferisco il server T-Coffee) dovrai stabilire quali sono le regioni strutturalmente conservate (SRC) sulla proteina X: in genere si tende a definire con le SRC le eliche e gli strand. Sulle SRC verranno trasferite direttamente le coordinate atomiche provenienti dalla proteina target (o perlomeno quelle relative agli atomi del backbone).
A livello di gaps e loops la situazione si complica un po' di piu': innanzitutto queste sequenze non dovrebbero essere piu' lunghe di 4-6 residui. A questo punto hai due scelte: o utilizzi la struttura di porzioni di sequenze analoghe provenienti da altre proteine (e qui ogni programma di modeling ha la sua bella libreria di strutture su cui cercare), o ti affidi alla ricerca dei possibili rotameri conformazionali. In entrambi i casi devi valutare bene quanti e quali clash interatomici potrebbero venire ad istaurarsi.
Solo dopo che sarai riuscito a cotruire il tuo frankenstein potrai ricorrere alla minimizzazione energetica: sicuramente non potrai minimizzare in un singolo passaggio ma dovrai utilizzare un approccio multistep. Io uso questo.
01) 150 cicli di steepest descent con il backbone congelato
02) 200 cicli di gradiente coniugato con il backbone congelato
03) 100 cicli di steepest descent con tethered force di 100 kcal/mol su tutti gli atomi (idrogeni esclusi)
04) 100 cicli di steepest descent senza vincoli
05) 800 cicli di gradiente coniugato senza vincoli
Il gradiente l'ho imposto sempre a 0.001
Prima di continuare con la dinamica molecolare (che è un calcolo dispendioso in termini di tempo) ti consiglio di fare una valutazione energetica preliminare sulla struttura minimizzata. Con PROSA avrai un idea se quello che hai fatto e' energeticamente accettabile o no. |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 11:42:57
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Korda la tua metodica è interessante, ma sinceramente ho qualche dubbio! Dunque:
ovviamente il modelling per omologia si fa a partire da una proteina con struttura nota (quella che si trova tramite blast come scritto sopra)...e le proteine a struttura nota sono risolte o con raggi X o con NMR. La risoluzione in Anstrom si usa solo per le proteine risolte con raggi X, per l'NMR si usa l'RMSD come parametro di "qualità".
Il programma per fare modelling per omologia gratis è Swiss PDB viewer...e credimi per fare il semplice modelling per omologia è più che sufficiente...considerando che il pacchetto Insight costa davvero tanto!
Stiamo parlando di modelling per omologia...il tuo protocollo è interessante, ma ha poco a che vedere con il modelling per omologia...mi spiego: se hai una identità di sequenza superiore al 70-75% non c'è bisogno di andare a controllare le eliche e gli strand (anche perchè come fai a sapere che sono regioni conservate...in che modo scopri che la proteina a struttura non nota ha zone ad elica o strand? dovresti fare una predizione di struttura secondaria...molto meno affidabile dei risultati del classico modelling per omologia)...si sovrappone la sequenza alla struttura nota e si aggiustano i gaps...molto più semplice, meno laborioso ed è dimostrato essere affidabile! Ricordarsi sempre che meno si maneggiano le strutture a mono e meglio è, si diminuisce la possibilità di creare artefatti!
Il protocollo di minimizzazioni è decisamente bello...e mi sa che telo copierò
Cmq se nn si ha un minimo di esperienza, partire con protocolli del genere su GROMACS e applicarli su modelli è dura forte! |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 14:16:48
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A dire il vero SwissPDBviewer non l'ho uso neanche come semplice viewer, quindi non sono ferrato sulle sue potenzialita': scusatemi...
Personalmente cerco di evitare le strutture NMR, ma è piu' una prassi che altro...
Citazione:
Messaggio inserito da Fil23
...in che modo scopri che la proteina a struttura non nota ha zone ad elica o strand?
Forse mi sono spiegato male: io non so se la proteina x ha zone ad elica o a strand...
D'altra parte se sovrappongo la sequenza alla struttura nota le coordinate di una SRC contenente uno strand sulla proteina target anche sulla proteina x descriveranno uno strand a quel livello più o meno (non ci si scappa). Solo successivamente minimizzazioni e MD ti daranno ragione o meno (ad ogni modo PROSA mi è tornato molto utile in questo senso)
P.S. x i webmaster: ma perchè questo topic è l'unico del forum con la formattazzione completamente sballata ? A differenza delle altre discussioni qui il testo dei post non viene adattato alle dimensioni della finestra del browser.... mah... |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 17:46:07
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Citazione:
Messaggio inserito da kORdA
P.S. x i webmaster: ma perchè questo topic è l'unico del forum con la formattazzione completamente sballata? A differenza delle altre discussioni qui il testo dei post non viene adattato alle dimensioni della finestra del browser.... mah...
Grazie per avermelo fatto notare kORdA.. pensavo fosse un capriccio del mio browser.
Era dovuto ai link postati da Fil23: il forum di principio non manda a capo gli url e non gli spezza, con il problema che se questi sono troppo lunghi, viene meno la formattazione di tutta la pagina.
Un soluzione e' quella di utilizzare un servizio chiamato Tinyurl (o uno dei tanti equivalenti), che permette di creare un alias per il collegamento troppo lungo. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 20:57:01
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Citazione:
Un soluzione e' quella di utilizzare un servizio chiamato Tinyurl (o uno dei tanti equivalenti), che permette di creare un alias per il collegamento troppo lungo.
o di usare il tag url del forum!  |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
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masavini
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2007 : 11:15:12
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ciao!
il link per il download di PROSA sembra non funzionare... qualcuno ha qualche idea su come ottenerne una copia?
grazie |
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masavini
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2007 : 16:42:44
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ok, mi rispondo da solo: PROSAII è ormai obsoleto, meglio usare PROSA 2003 (fate un giro su google, e trovere tutto ciò che serve...)
ciao a tutti!!
happy modeling!
teo |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2007 : 19:30:32
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Citazione:
Messaggio inserito da masavini
ok, mi rispondo da solo: PROSAII è ormai obsoleto, meglio usare PROSA 2003 (fate un giro su google, e trovere tutto ciò che serve...)
ciao a tutti!!
happy modeling!
teo
Oltretutto ho notato che c'è pure un webserver per Prosa; non c'è neanche bisogno di scaricarlo |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Ale_90
Utente Junior
296 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 22:40:42
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Cough Cough Cough.......
Tolta la polvere da questo 3D, domando se qualcuno ha il buon cuore di consigliarmi:
A) Un buon programma di homology modeling
B) Un altrettanto buon tutorial per niubbi come il sottoscritto.
Il mago dell'homology modeling del mio lab mi aveva parlato di Yasara ed introdotto ai segreti del suddetto programma, ma il sopraggiungere del suo esame di dottorato mi ha impedito di approfondire oltre...qualcuno può aiutarmi? |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
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