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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2008 : 14:58:42
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ciao a tutti magari questa nuova discussione è stata gia fatta,qualcuno sa dirmi se si fiderebbe in un esperimento di real time di un gene housekeeping che "esce" a un CT di 14 (è il 18S) mentre il mio gene esce tardi...a 37? cambiereste gene houskeeping...grazie ciau ciau
beppe
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 15:05:59
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| E' normale che il 18S esca così presto, penso che sia così ( chi più chi meno) per tutti coloro che lo usano. Il gene housekeeping va scelto in considerazione di fattori che non sono il n° di cicli ai quali esce, ma altri di cui ti parlerà sicuramente e dettagliatamente GFPina se ti interessa saperlo, mi spiace, ma ora sto scappando a riprendere mio figlio a scuola. |
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 15:08:47
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grazie mille!!!buon pomeriggio!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 18:07:32
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Citazione:
Messaggio inserito da cin
... ma altri di cui ti parlerà sicuramente e dettagliatamente GFPina ...
Va beh... visto che sono stata tirata così in ballo... cercherò di fare una spiegazione sull'utilizzo degli housekeeping... sperando che sia utile anche ad altri!
Come ha accennato cin non è importante il “numero di cicli” o meglio a che livello a cui esce o meglio a che livello è espresso il gene housekeeping. La cosa importante è che sia STABILE cioè non vari nelle tue condizioni sperimentali. Poi come ho già spiegato, in realtà sarebbe meglio normalizzare contro più di un housekeeping , molti dicono che il minimo sia tre!
Il modo di procedere "corretto" sarebbe questo:
utilizzare più geni housekeeping e "testarli" varie condizioni sperimentali (diversi tessuti, cellule con un determinato trattamento...) in modo da vedere quali sono i più stabili ed utilizzare poi quelli per normalizzare il gene di interesse. I geni housekeeping che vanno bene per un determinato esperimento non vuol necessariamente dire che vadano bene anche per un altro. Ad es. un certo gene può essere stabile se lo studi in vari tessuti di un organismo, ma non lo è più in cellule trattate o non trattate con una determinata sostanza. Va scelto a secondo delle varie condizioni sperimentali. Ad es. se so che un certo trattamento modifica il citoscheletro non utilizzerò come housekeeping actina (io non lo utilizzerei comunque mai! Ma sono mie considerazioni personali)
Comunque sulla scelta dei geni housekeeping posso consigliare due pubblicazioni:
Selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies in striped dolphin (Stenella coeruleoalba) skin biopsies
Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes
Poi utilizzo questo software… anzi "applet" (prima che gli informatici e bioinformatici mi dicano qualcosa ) per vedere quali sono i geni più stabili (è quello descritto dalla seconda pubblicazione):
geNorm
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 18:36:23
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grazie mille per le informazioni, leggendo il blog e i tuoi commenti li ho sempre trovati interessanti e utili, nel mio lab ho anche gapdh..provo a usarla... buon wee  |
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daruma
Nuovo Arrivato
Città: Stuttgart
12 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 16:48:21
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salve a tutti,
sono nuovo del forum, avrei una domanda forse per certi versi molto banale... se ho un gene housekeeping, e usando dei primers specifici avvio una PCR normale (quindi con DNA genomico9 |
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daruma
Nuovo Arrivato
Città: Stuttgart
12 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 16:50:21
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scusate mi si era impallato il pc... continuo dal messaggio precedente, dicevo, con DNA genomico, e' normale che riesco a cavarne nessuna banda visibile? e' possibile che questi primers funzionino solo con cDNA?
grazie della risposta che vorrete darmi!
saluti,
DARIO |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 17:05:26
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Citazione:
e' possibile che questi primers funzionino solo con cDNA?
Sì, è molto probabile. Generalmente i primer da usare in esperimenti di RT (real time o classica, non importa) sono fatti a cavallo di 2 esoni, proprio per evitare di amplificare il genomico. |
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daruma
Nuovo Arrivato
Città: Stuttgart
12 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 17:09:03
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grazie mille chick80! cosa fai in francia? studi la'? io sono Dario, anzitutto grazie della risposta e poi... molto piacere di conoscerti!
provero' una sintesi di cDNA e poi una RT classica! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 18:04:50
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Di nulla, figurati. In Francia faccio l'ingénieur de recherche (che in pratica è un postdoc) in neuroendocrinologia.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 00:34:39
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Ciao Dario, benvenuto sul forum! 
La motivazione te l'ha già data chick80, aggiungo solo che la prima cosa che dovresti fare con i primer (che presumo non abbia disegnato tu) sarebbe fare un blast con la sequenza dei primers e vedere a cosa si attaccano. Se riconoscono per caso DNA genomico o solo RNA (cDNA).
Comunque in genere per testare dei primers per real-time si fa appunto una RT-PCR tradizionale.
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d.goldy
Nuovo Arrivato
39 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 12:10:54
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Ciao a tutti
So che questo post é piuttosto vecchio ma mi sembra perfetto per la mia domanda.
Quanti geni hanno Gapdh e beta actina? Ho fatto una insilico con il programma di UCSC e mi sono venuti fuori un po' di amplicon tutti uguali eccetto 2. A voi risulta?
Spero di essere stata chiara
Grazie |
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