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Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 13 giugno 2011 : 18:54:52

Ho gi� dato un'occhiata ai tanti topic che trattano i metodi di sequenziamento a livello genomico con sequenziamento gerarchico e con shotgun; vorrei solo chiedervi se quello che scriver� � corretto o meno, ho bisogno di una semplice conferma su quello che ho capito!

Vi metto un (*) in particolare nei punti dove ho pi� dubbi.

Sequenziamento gerarchico (innanzitutto la dicitura � corretta? o � meglio definirlo "shotgun gerarchico"?): Il genoma di partenza, o anche solo un cromosoma di esso, viene frammentato per sonicazione o con enzimi di restrizione* fino ad ottenere grandi frammenti (50-200kb) che vengono cos� inseriti in vettori da clonazione come BAC che una volta trasformati in batteri ospiti daranno vita ad una biblioteca genomica di grandi frammenti (che verranno cos� amplificati).
Si passa cos� ad "ordinare" i precedenti lunghi inserti per ottenere la stessa sequenzialit� propria del cromosoma originale; questo viene realizzato tramite algoritmi informatici che confrontano le sequenze delle estremit� di ogni frammento con le altre estremit� in "overlap" con altri frammenti (contigs)*. Questo consente di ottenere una mappa fisica del cromosoma, utile per i passaggi seguenti. Non tutti gli inserti saranno utili a tale fine, infatti verranno selezionati solo quelli per comporre un "minimal tiling path" *(questa "scelta" � sempre affidata a strumenti informatici? e si basa sempre sulle sequenze alle estremit� dei frammenti?).
La penultima fase comprende uno shotgun dei frammenti cos� scelti, ovvero la loro frammentazione random in corte sequenze ora facilmente sequenziabili. Non rimane ora che inserire i dati cos� ottenuti in un software apposito che ci fornir� la sequenza globale "pi� probabile" tenendo anche conto della provenienza di ogni cluster di piccoli frammenti sequenziati (in base alla precedente mappa fisica).
*E' giusto parlare in questo caso di cromosome walking? E mi potreste riassumere il suo concetto?

Shotgun (ha altri nomi?): in questo caso il genoma di partenza viene direttamente frammentato a random *(con sonicazione?) fino ad ottenere piccoli frammenti gi� sequenziabili. Questi frammenti vengono inseriti in vettori *(quali? anche semplici plasmidi?) per la loro amplificazione. Si passa al loro sequenziamento *(con quale metodo? anche la semplice variante di Sanger dei ddNTPs con basi pigmentate e lettura laser?). L'ultimo passo � ancora il riassemblamento con algoritmi informatici dei frammenti su base delle sequenze contigs che porta ad una sequenza globale dell'intero cromosoma *(o genoma?)

Ci ho capito qualcosa o sono da rilegare?

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 14 giugno 2011 : 16:12:58

Non � che mi aspetto una trattazione di ogni singolo asterisco che ho infilato nella descrizione...ma neanche un'opinione? O almeno ditemi se ho fatto errori madornali!

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2011 : 20:43:53

Nessuna buon anima per una risposta?

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2011 : 19:07:40

Non vorrei spammare qui, ma davvero non c'� nessuno che mi possa dare una miniconferma che non sono totalmente nel mondo della fantascienza??

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