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knibio
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 Inserito il - 14 ottobre 2006 : 18:58:22
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Cercavo delle spiegazioni abbastanza esaurienti riguardo ad alcune sonde di ibridazione usate in Real Time PCR, in particolare Dual Oligo FRET Probes, Scorpion Primers e Amplifluor Primers. Qualcuno di voi saprebbe aiutarmi???  Grazie. 
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 15 ottobre 2006 : 23:06:24
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Non so se capirai molto, poichè queste cose necessitano di immagini. Se ti interessa, posso passarti un file dove potrai capire benissimo il funzionamento, osservando le immagini mentre leggi quello che ho scritto! 
- Fret probes: Si utilizzano 2 primers e due sonde diverse che ibridizzano sul target una di seguto all'altra in modo che l'estremità 5' della prima sia vicina all'estremità 3' della seconda (ibridazione testa-coda).
La prima sonda reca alla estremità 5' un fluoroforo (donatore), la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente all'estremità 3' dell'altra sonda.
Solo l'emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector.
E' importante, quindi, che entrambe le sonde siano appaiate.
Nota bene, il donatore ha un 3' libero, che la Taq potrebbe riconoscere come primer.
Ma questo non accade, poichè questa estremità ha al 3' un blocco chimico (glicole esaetilenico) che fa si che non venga allungata dalla Taq polimerasi.
- Scorpions primer: è una sonda senza idrolisi, anzi è praticamente un primer che incorpora una sonda in una struttura a forcina.
Il loop ha una sequenza complementare al filamento neosintetizzato dopo l'estensione 3' del primer (e non quindi al filamento iniziale).
Il loop determina il ribaltamento della sonda come la coda di uno scorpione; la forcina si apre e il loop si appaia ala catena neosintetizzata.
Le due braccia dello stem contengono le due molecole R e Q.
In sintesi, dopo la fase di polimerizzazione, la forcina si apre e si appaia alla catena neosintetizzata e il Quencher si allontana dal Reporter ed è emessa fluorescenza.
- Amplifluor primers: anche questo è un primer che incorpora la sonda.
Durante la fase di estensione, la stessa sonda funge da stampo per la sintesi del nuovo filamento.
Questo porta all'apertura della forcina e all'allontanamento del Q dal R, con emissione di fluorescenza.
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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knibio
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 20 ottobre 2006 : 11:42:45
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Se mi mandassi il file mi faresti un grosso favore. Ti ho inviato anche una mail, grazie mille!
FORZA BARI! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2006 : 13:43:30
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| Te lo mando via email in questo fine settimana, poichè adesso non lo ho più su questo computer, ma solo sul portatile. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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knibio
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2006 : 18:58:52
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 Perfetto, grazie!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2006 : 23:22:05
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Ok, sono riuscito a farlo il prima possibile.
Ho mandato il file all'indirizzo email che mi avevi dato. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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gle86
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2008 : 16:35:49
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 SYBR Green
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA. All’inizio del processo di amplificazione la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente. Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. Durante l’allungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’aumento del numero di copie dell’amplicone. Metodo non specifico perché SYBR Green si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers. E’ necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici.
Sonda Taqman
La sonda ha un fluoroforo in 5' detto “reporter”, mentre in 3' ha una molecola detta “quencher”.
-il reporter è un fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza
-il quencher è un fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter
Se “reporter” e “quencher” si trovano vicini, il quencher assorbe i fotoni del reporter. Quando la Taq polimerasi procede in 5'->3' libera reporter e quencher che si staccano. Il reporter emette fluorescenza che è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati.
Sonde FRET
La metodica prevede due sonde che si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate. Ognuna delle sonde è marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore). Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall’accettore non è rilevato. Durante lo step di annealing, entrambe le sonde FRET ibridizzano con le sequenze target. Ciò avvicina il fluoroforo donatore all’accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte, dell’accettore, che viene rilevato.
Molecular Beacons
I “molecular beacons” contengono un fluoroforo e un quencher non fluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide, che sono disegnate in modo da essere complementari tra loro formando una struttura stem-loop. Il loop è complementare ad una sequenza all’interno del prodotto amplificato. La vicinanza del quencher al reporter fluorescente impedisce l’emissione di fluorescenza. Durante lo step di annealing, la sonda ibridizza la sequenza target, ciò separa il colorante fluorescente dal quencher, producendo un segnale fluorescente. La quantità di fluorescenza prodotta ad ogni ciclo, o dopo PCR, dipende dalla quantità di prodotto specifico.
Sonda Scorpion
La sonda nel terminale 3' ha una sequenza, PCR primer, che è specifica per l’estensione del target. Questa sequenza è legata al terminale 5' di un primer per mezzo di un “blocker”.
Step 1: lo Scorpion primer è esteso su DNA target.
Step 2: durante il processo di denaturazione si verifica l’allontanamento del quencher dal reporter, e del primer di innesco dal DNA target.
Step 3: raffreddandosi lo scorpion esteso subisce un riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera target specifica. Un primer non esteso viene quenciato.
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gle86 |
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gle86
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2008 : 16:42:13
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Citazione:
Messaggio inserito da knibio
Cercavo delle spiegazioni abbastanza esaurienti riguardo ad alcune sonde di ibridazione usate in Real Time PCR, in particolare Dual Oligo FRET Probes, Scorpion Primers e Amplifluor Primers. Qualcuno di voi saprebbe aiutarmi??? Grazie.
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gle86 |
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afrodite81
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Città: Bari
10 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 13:13:44
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| eh bravo Luisssss :) |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 13:27:20
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Citazione:
Messaggio inserito da afrodite81
eh bravo Luisssss :)
Anche qua! ti ritrovi! |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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afrodite81
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Città: Bari
10 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2009 : 18:20:51
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Eiiiii Luis,non avevo letto la risposta sul forum...Senti io sto studiando la real time di De Caro.Vorrei farti una domanda sul disegno dei probes:perchè in questo caso il è necessario che il probe non abbia G all'estremità 5'...?Grazie...anche se risponde qualcun'altro |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 17:17:54
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| Guarda, non ricordo esattamente, però vagamente mi sembra sia dovuto alla capacità di legame e soprattutto di distacco della sonda...Dovrei controllare meglio! |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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