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verocep
Nuovo Arrivato
36 Messaggi |
 Inserito il - 18 gennaio 2012 : 16:15:34
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CIao! Ho bisogno che qualcuno mi aiuti a capire in che modo la PCR real time può essere utilizzata per la tipizzazione allelica(omozigote-eterozigote)!!
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2012 : 16:25:28
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Sicuramente la TaqMan RT-PCR ti può aiutare per la tipizzazione...usi una sonda TaqMan marcata con due fluorofori diversi (fluoroforo A per l'allele 1, fluoroforo B per l'allele 2) e dal plot di amplificazione puoi discriminare i vari genotipi dei tuoi campioni.  |
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verocep
Nuovo Arrivato
36 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2012 : 18:34:16
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| Si è proprio questo che ho scritto negli appunti..ma non ho capito bene, me la puoi spiegare perfavore? Per tipizzare un gene, ad esempio uso un numero di sonde TaqMan pari al numero di alleli conosciuti per quel gene ogniuna cn un fluoroforo diverso, e in base ai fluorofori che mi appaiono capisco i tipi di alleli? Ma a cosa serve la quantificazione della real time? |
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2012 : 21:36:43
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| beh di solito la TaqMan la usi se vuoi studiare ad esempio uno SNP...Non so cosa tu intenda con "alleli conosciuti"...Comunque, la TaqMan Real-Time PCR è una tecnologia che permette di genotipizzare un campione analizzando la fluorescenza emessa dallo stesso in tempo reale...in questa tecnologia, la valutazione quantitativa dell’acido nucleico è affidata alla rivelazione e alla conseguente quantificazione di un ‘reporter’ fluorescente, il cui segnale cresce in maniera proporzionale alla quantità di prodotto di PCR nella reazione....in sostanza viene disegnata la sonda gene-specifica che si appaia nella zona compresa fra i due primer (forward e reverse) e questa sonda contiene un colorante fluorescente (reporter) all’estremità 5’ ed un colorante spegnitore (quencher)all’estremità 3’. In condizioni di normale appaiamento sonda-DNA stampo, se il campione viene irradiato, l’energia fluorescente emessa dal colorante ad alta energia in 5’ viene assorbita totalmente dal quencher a bassa energia. Fino a quando la sonda resta intatta, la vicinanza tra reporter fluorescente e quencher annulla l’emissione del segnale di fluorescenza perché si verifica un trasferimento di energia dal primo al secondo. Nel momento in cui la DNA-polimerasi, replicando lo stampo, incontra la sonda appaiata al suo interno, grazie alla sua attività esonucleasica 5’#8594;3’, comincia a degradarla. L’allontanamento tra il reporter ed il quencher pone fine all’attività di assorbimento di quest’ultimo e fa in modo che il reporter inizi ad emettere fluorescenza e quest’ultima, incrementerà ad ogni ciclo in maniera proporzionale al tasso di degradazione della sonda.... l’accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando, quindi, l’incremento di fluorescenza del reporter. |
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