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chantalle
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 13:32:44
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Ciao atutti!come, quale reagente e in che proporzione devo variare in un protocollo PCR per aumentare l'intensità della banda visualizzata su gel di agarosio?grazie e buon lavoro a tutti
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 13:58:28
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La PCR non centra niente (solitamente) .Se puoi naturalmente carica + DNA (eventualmente fai 2 reazioni dello stesso campione ed unisci il contenuto). Se no dipende dal metodo di colorazione che usi (etidio?), puoi mettere + colorante (se etidio fai correre il gel meno perchè tende a migrare verso il polo positivo) oppure colorare dopo la corsa incubando il gel con il colorante ed il buffer utilizzato per la corsa, oppure (se non è etidio) lo aggiungi direttemente anche nel buffer di corsa prima della stessa. Ci sono varie strategie, ma comunque se è proprio la PCR che fa schifo, ci sarebbero mille prove da effettuare, comincia a cambiare le concentrazioni di primer e ioni MgCl2+, ed eventualmente diluisci il campione per vedere se cè qualche effetto inibitorio (si potrebbe aggiungere anche BSA). |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 17:28:11
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chantalle,
dovresti essere più specifico... le procedure possono essere infinite, dipende da cosa hai al momento e cosa vuoi ottenere.
1) aumentare i cicli di PCR, 2) aumentare il DNA di partenza o diminuirlo se sei a saturazione 3) aumentare la purezza del DNA da cui parti 4) aumentare la Taq che usi 5) aumentare il volume della PCR o mettere insieme diverse PCR 6) se vuoi concentrare puoi fare una precipitazione con sali ed alcool 7) se vuoi una grossa amplificazione puoi clonare il prodotto ed amplificarlo in batteri 8) puoi diminuire la Tm per facilitare l'annealing ed il prodotto di PCR 9) puoi fare una nested. 10) puoi aumentare il diaframma quando fai la foto
etc etc etc
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