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senzacuore03
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 02 ottobre 2008 : 12:07:00
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ragazzi aiutatemi ho dei seri problemi a capire un articolo. hanno fatto un costrutto co pGEM-T e una egione intronica di un gene pr vedere se aveva una funzione di enhancer con i saggi di luciferasi. come cavolo si fa? come faccio a inserire una regione? come lo faccio il costrutto in parole semlici?
aiuto!!! grazie a tutti
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2008 : 12:44:14
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Usando degli enzimi di restrizione che ti tagliano il plasmide e ti creano delle estremità coesive e poi ligando insieme plasmide tagliato e regione che vuoi clonare debitamente tagliata (Cioè con le estremità complementari).
PS per favore usa tutte le lettere di una parola, non stai scrivendo un SMS! |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2008 : 20:17:58
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Ti consiglio la guida di un esperto, quello che ti stai apprestando a fare non è facile.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2008 : 21:55:44
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Citazione:
Messaggio inserito da Neuroscience
Ti consiglio la guida di un esperto, quello che ti stai apprestando a fare non è facile.
Beh dai capire un articolo non è poi una cosa così complicata, basta avere delle indicazioni di base sulle tecniche utilizzate! 
Comunque esistono varie tecniche ma la più utilizzata è sicuramente quella che prevede l'utilizzo di enzimi di restrizione. Ovviamente non possiamo sapere esattamente come hanno fatto in quell'articolo. Ma il linea generale il procedimento può essere questo:
- amplifichi mediante PCR la regione che ti interessa utilizzando dei primers che contengano siti per enzimi di restrizione
- tagli frammento amplificato e vettore con enzimi di restrizione (ovviamente devono essere gli stessi affinchè le estremità siano complementari)
- fai avvenire la ligazione tra frammento e vettore mediante una ligasi
ed ecco pronto il tuo costrutto!
Esistono variante a questo schema.
Ovviamente poi nella pratica non è tutto rose e fiori, si possono incontrare vari problemi!
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senzacuore03
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2008 : 15:14:46
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ciao a tutti, finalmente ho il tempo per risponderevi. prima di tutto non scrivo come nei messaggi ma dalla fretta ho saltato delle parole!!!
ho degli aggiornamenti. non è cosi semplice perche parto da un dna a doppia elica quindi mi hanno detto che prima devo inserirlo in un vettore tipo pGem o pMOs, isolare l'elica che mi interessa(come??!!), purificare tagliare e poi inserire nel vettore con la luciferasi, con un dubbio pero se metterlo con un minimo promotore oppure proprio senza neinte per vedere l'attivita di enhancer. bene non ho capito nulla!!!!!! |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2008 : 15:32:49
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Secondo me non significa che devi clonare i singoli filamenti.
Tu cerchi una regione regolatrice, che puù essere sia nel filamento + che in quello -.
Probabilmente dovrai clonare direzionando il frammento (una volta A--------B e poi B----------A, per quel che riguarda lo step sucessivo direi con il promotore, un enhancer non promuove |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Discussione |
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come fare un costrutto...aiuto!!
Didattica
