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giuseppe.gangarossa
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 02 novembre 2008 : 00:20:45
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Ciao a tutti!
Vorrei chiedervi un paio di cose sul western blot...
1) E' possibile recuperare e riutilizzare, almeno 1-2 volte, il running buffer e/o il buffer di trasferimento dopo un esperimento?
2) Sarebbe corretto recuperare e riutilizzare, naturalmente per pochissime volte, la soluzione diluita di anticorpo primario usata nell'incubazione di una membrana?
3) Lo stripping può creare delle sfasature nelle letture? Oltre ad andare a dissociare il complesso anticorpo-proteina si può rischiare che la quantità proteica sia abbattuta? Chi di voi possiede un buon metodo di stripping? Ho provato a strippare le mie membrane ma se metto l'ECL subito dopo riesco ancora a rivelare le bande (più chiare, ma ci stanno...)
Grazie mille 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2008 : 08:45:06
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Citazione:
E' possibile recuperare e riutilizzare, almeno 1-2 volte, il running buffer e/o il buffer di trasferimento dopo un esperimento?
Sì, senza problemi. Non farlo per gli esperimenti importanti ovviamente... :)
Citazione:
Sarebbe corretto recuperare e riutilizzare, naturalmente per pochissime volte, la soluzione diluita di anticorpo primario usata nell'incubazione di una membrana?
Certo, a seconda della bontà dell'anticorpo lo puoi riutilizzare anche 3-4 volte. Stesso vale per l'immunoistochimica
Citazione:
Lo stripping può creare delle sfasature nelle letture? Oltre ad andare a dissociare il complesso anticorpo-proteina si può rischiare che la quantità proteica sia abbattuta? Chi di voi possiede un buon metodo di stripping? Ho provato a strippare le mie membrane ma se metto l'ECL subito dopo riesco ancora a rivelare le bande (più chiare, ma ci stanno...)
Sì, lo stripping generalmente diminuisce le proteine totali, quindi ti conviene sempre fare prima il blotting delle proteine meno espresse.
Protocollo per stripping: http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=27
PS: Dopo lo stripping lava bene in TBS-T o PBS-T. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2008 : 10:00:33
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| Mah, a parte che di solito bloccavo la corsa prima che il fronte uscisse dal gel... comunque non ho mai avuto problemi. |
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giuseppe.gangarossa
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2008 : 14:07:39
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Anche io blocco prima che il fronte esca dal gel...quindi credo che da domani comincerò a risparmiare sia sui buffers che sugli anticorpi.
Quello che non capisco è lo stripping...Se strippando mi si abbassa la quantità proteica quando poi vado a sviluppare non effettuo una lettura errata?
Grazie per i consigli! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2008 : 14:11:33
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No, se rapporti sempre al controllo interno (es. actina)
Comunque non si abbassa di così tanto, almeno non nella mia esperienza |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 09:05:50
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| io uso come stripping buffer quello della pierce...strippa molto bene e non causa delle grosse perdite di proteine. ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 21:33:45
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Beh io sono contraria allo stripping preferisco fare una doppia marcatura sulla stessa membrana se so già che le bande vengono fuori belle nette, oppure tagliare in due la membrana e incubare con i due anticorpi, poi ricomporre la membrana prima di sviluppare!
Per buffer mai avuto problemi con il riciclo.
Per gli anticorpi dipende, alcuni non funzionano molto bene, altri invece si. Una volta siamo arrivati a riutilizzarlo 10/11 volte  , ma è stato un caso particolare era un anticorpo che non producevano più!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 23:33:13
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Se puoi fare tutto in una corsa è meglio, e in più risparmi tempo e reagenti!
Tagliare la membrana fa un po' paura le prime 2 o 3 volte ma poi diventa una cosa facile (fino al giorno in cui tagli esattamente in mezzo alla tua banda.) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 23:34:13
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Eh, ma a volte dello stripping non puoi fare a meno se le due bande sono molto vicine...
Beh si ma sono casi più "rari".
Anche per proteina totale e fosforilata! Ma io preferisco fare 2 gel!
(ognuno ha le sue fisse )
Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Ma solo io faccio 2 gel diversi per 2 anticorpi diversi?
Beh dipende da cosa devi fare, per quantificare dovresti essere sicuro di aver seminato le stesse quantità (a parte differenze che ci possono essere nei due gel). Se tagli la membrana sei sicuro che il campione è esattamente lo stesso! Se poi si tratta di campioni "preziosi", poter incubare la stessa membrana con 2/3 anticorpi è sicuramente un vantaggio! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2008 : 23:36:21
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
...(fino al giorno in cui tagli esattamente in mezzo alla tua banda.)
Ah ma si possono fare degli ottimi collage!!!
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tiz83
Nuovo Arrivato
Città: smallville
72 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2008 : 17:34:03
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| io, quando faccio i blot running e transfer non li recupero mai...li preparo ogni volta....Gli anticorpi recupero solo quelli in BSA e gli aggiungo sodio azide allo 0.02%, in milk le conservo solo se mi servono x il giorno dopo. X lo stripping devi lavare molto bene il blot fino a far scomparire la puzza di betamercapotoetanolo..Lo stripping lo faccio a 60°C per 20'..... |
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