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brunacell
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 05 novembre 2008 : 12:05:59
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Salve,
spero che qualcuno possa aiutarmi.
Vorrei sapere come posso confrontare le sequenze di due primers con la sequenza nucleotidica del mio gene.
Andando sullo specifico:da un articolo ho trovato dei primers per il fattore XIII (ma questo lavoro devo farlo anche per altri fattori),vorrei trovare corrispondenza tra questi e le sequenza genica,sono entrata su pubmed e da lì su FASTA, penso di aver trovato la sequenza nucleotidica giusta ma non riesco a trovare le sequenze dei due oligo.
Cosa sbaglio?
Per favore qualcuno mi risponda il più velocemente possibile.
Grazie.
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 17:23:37
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| Cosa sbagli è un pò difficile dirlo. Prova a fare un blast con il primer fw, magari ti esce la sequenza che volevi (ricorda che per trovare il primer rv devi usare la sequenza capovolta complementare) |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 17:54:28
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Devi trovare un tool che ti permetta di fare una 'in silico pcr'.
C'e' questo classico di ucsc, ma si applica all'intero genoma (cosi' vedi se avrai prodotti spuri):
- http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
Oppure cerca su internet/pubblicazioni un tool apposito.
Appena ho tempo ti rispondo meglio :).
Comunque, vedi se trovi qualcosa di interessante nel topic dei primers:
- http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1655 |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:07:38
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Beh la prima cosa comunque è fare un blast per vedere se riconosce la tua sequenza o altro!
Poi c'è un programmino molto semplice da usare in cui metti la tua sequenza, i primers e glieli fai cercare sulla sequenza. Poi puoi anche selezionarli e ti dice la grandezza del frammento amplificato!
Puoi anche fare la ricerca con 1 o più mismatch.
Si chiama AnnHyb è free e rilasciato secondo la "GNU General Public License" (cosa che piacerà sicuramente a dallolio_gm  ).
Io stavo usando ancora una versione vecchissima, ma è da poco uscita l'ultima versione, la scarichi qui!
L'utilizzo è davvero intuitivo, ma se hai bisogno scrivi!
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:45:38
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Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare... e detto fra noi secondo me molta gente che dovrebbe refertare gli articoli non controlla i primer perchè a me è capitato più di una volta o di non trovarli proprio nella sequenza o trovarli ma diversi (e non mi riferisco all'inserimento di siti di restrizione).
ciaoooo |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 19:25:56
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Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA
Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare...
Potrebbe non funzionare:
- se ti dimentichi di cambiare maiuscole/minuscole
- se ci sono delle 'N' o delle basi indicate ambiguamente
- se ci sono degli 'a capo' o degli spazi (in genere le sequenze fasta vanno a capo ogni 80 caratteri)
Inoltre, essendo un metodo 'manuale', non e' riproducibile, ovvero anche se lo fai, non puoi dimostrare di averlo fatto correttamente. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 19:54:44
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si si basta stare 1 pò all'occhio diciamo...e tenere presenti queste cose... al massimo cercare non tutta la sequenza del primer ma solo un pezzo e poi guardare l'intorno... le sequenze in fasta sono in maiuscolo e se nella ricerca scrivi in minuscolo li trova lo stesso inoltre gli spazi in fasta non c sono bisogna stare eventualmente attenti alla 'a capo', poi per quel che riguarda le N personalmetnte in banca dati non le ho mai trovate solo nei sequenziamenti
ah poi è meglio impostare courier come carattere
Io così facendo mi son sempre trovata bene anche perchè essendo già in word posso segnare sottolinenando evidenziando ecc dove annealano i primer di quante paia basi sarà l'amplificato (conteggio parole)e così via |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 20:04:50
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Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA
Oppure puoi copiare la sequenza FASTA del gene in word e cercare i primer come se fossero parole usando il comando'Trova'chiaramente per il reverse devi cercare il complementare...
Sono d'accordo con dallolio!!!
E poi comunque è un metodo un po' barbaro, se esistono programmi per farlo, che ripeto sono free, perchè non utilizzarli?
Inoltre appunto nel caso i primers non siano esattamente complementari alla sequenza ma ci siano dei mismatch il programma te li trova comunque e ti indica in quale base c'è il mismatch! Farlo manualmente sarebbe impensabile, dovresti provare tutte le possibili combinazioni!
Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA
... a me è capitato più di una volta o di non trovarli proprio nella sequenza o trovarli ma diversi ...
Appunto per quello è bene fare un blast!!!
Il caso di trovare in letteratura primers che non siano completamente complementari alla sequenza non poi così raro (anche a me è capitato spesso), aggiungere dei mismatch all'interno del primer può servire per migliorare la stabilità del primer (impedire che formi hairpin o dimeri, cambiare la sua Tm...) e comunque se la sequenza è abbastanza specifica e non si attacca da altre parti non inficia la riuscita della PCR. Anche in questo caso è fondamentale fare un blast dopo averli disegnati, e ovviamente non cambiare i nt al 3'!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 20:18:32
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Citazione:
Messaggio inserito da MaryngA
si si basta stare 1 pò all'occhio diciamo...e tenere presenti queste cose... al massimo cercare non tutta la sequenza del primer ma solo un pezzo e poi guardare l'intorno... le sequenze in fasta sono in maiuscolo e se nella ricerca scrivi in minuscolo li trova lo stesso inoltre gli spazi in fasta non c sono bisogna stare eventualmente attenti alla 'a capo', poi per quel che riguarda le N personalmetnte in banca dati non le ho mai trovate solo nei sequenziamenti
ah poi è meglio impostare courier come carattere
Io così facendo mi son sempre trovata bene anche perchè essendo già in word posso segnare sottolinenando evidenziando ecc dove annealano i primer di quante paia basi sarà l'amplificato (conteggio parole)e così via
Tutte cose che fai in automatico con il programma!!!
E molto più velocemente credimi! 
Se comunque poi ci tieni ad avere anche i primers indicati in Word, basta che guardi a che basi si attaccano e li evidenzi successivamente in Word!
Ah funziona anche il fantastico "Copia e Incolla", così hai già la tua bella sequenza in word con i numerini di fianco, senza stare a metterli a mano  , con vari trucchetti  , o con tools appositi per word  (esistono anche quelli e ti semplificano la vita!!!)
Perchè non provi e poi vedi il tempo che risparmi!!!
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 09:14:01
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Poi c'è un programmino molto semplice da usare in cui metti la tua sequenza, i primers e glieli fai cercare sulla sequenza. Poi puoi anche selezionarli e ti dice la grandezza del frammento amplificato!
Puoi anche fare la ricerca con 1 o più mismatch.
Si chiama AnnHyb è free e rilasciato secondo la "GNU General Public License" (cosa che piacerà sicuramente a dallolio_gm ).
Eee...questo non lo conoscevo...c'è sempre da imparare!!!
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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brunacell
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 10:15:19
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Grazie mille per le vostre risposte.
Proverò a mettere in pratica i vostri consigli e vi farò sapere.
Buon lavoro e buona giornata. |
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