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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
 Inserito il - 14 novembre 2008 : 09:39:17
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Buongiorno
Secono voi,come si potrebbero precipitare dei plasmidi di circa 8kb risospesi in isopropanolo 70% + H2O ?
a me sembrano spariti dopo essersi formata una medusa di DNA,premetto che li ho messi in ghiaccio e centrifugati a 12g,ma non c'e' piu' niente..dovrei caricarli sul gel per vedere che esce
tutte le ipotesi sono ben accette
Intanto provero' con i sali...cercando di capire quanto metterne
Tnx
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 13:58:43
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ho fatto !!! evviva il sale da cucina
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 18:38:12
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ehehe,non sarebbe male fare il cuoco..ho gia' avuto esperienza
allora ho precipitato tutto portando la mia soluzione a 0,5M di NaCl
vortexato
ho messo a -20 per una 20 minuti
centrifugato per 15 minuti a 12g
eliminato l isopropanolo
lavato con il 70% di etanolo
asciugato e risospeso in TE
evviva la sineddoche !!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 19:19:51
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Mah?  Sinceramente mi hai fatto sorgere un paio di curiosità...
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
Buongiorno
Secono voi,come si potrebbero precipitare dei plasmidi di circa 8kb risospesi in isopropanolo 70% + H2O ?
Innanzitutto come mai avevi i plasmidi in isopropanolo 70%?
E poi in cos'altro dovrebbe essere l'isopropanolo al 70% se non in acqua?
Ma sopratutto!!!
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
...premetto che li ho messi in ghiaccio e centrifugati a 12g...
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
...centrifugato per 15 minuti a 12g...
Come hai fatto a centrifugare a 12g??? 
Hai centrifugato a mano??? 
No perchè considerando una normale mini-centrifuga da banco il cui diametro è attorno agli 8.5cm, facendo i dovuti calcoli viene 355rpm! 
Non credo neanche si possa impostare una velocità così bassa!!!
Dai se vuoi per Natale ti regalo una centrifuga così la prossima volta fai prima!!!
Comunque giusto per informazione generale anche se il problema è risolto:
per riprecipitare si utilizza una concentrazione finale di NaCl intorno a 0,3-0,5M (NaOAc alla stessa concentrazione o LiCl 0,8M) e circa 1 volume di isopropanolo o 2 volumi di etanolo (100%). I lavaggi poi è meglio farli in etanolo 70% (non isopropanolo 70%), per essenzialmente 2 motivi: primo l'isopropanolo è meno volatile dell'etanolo, secondo con l'etanolo vengo eliminati meglio i sali dal pellet che darebbero fastidio per la risospensione!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 19:32:41
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prima domanda:
leggiti il kit qiagen midiprep e chiedilo a loro che ci faceva il DNA,ho messo + H2O per precisare
per la centrifuga io mi ricordavo che la mia 12 g corrispondevano a 13 mila RPM,pero' rifaccio i conti..magari mi sono sbagliato(la settimana prossima pero',che mo sto giusto altri 20 minuti che mi finisce la marcatura e me ne devo scappare)
IL fatto che tu mi abbia messo li che per precipitare si usa ...l ambaradan,e' un protocollo,
la mia era una domanda per sapere come uscire da un guaio ,visto che in genere prima si usano i sali e poi l isopropanolo
ok tie',da protocollo 20 mila x g ,la mia arrivera' a 12 mila x g |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 20:06:49
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Dai Patriciuccio non fare il permaloso perchè una volta si fa notare qualcosa a te!!!
Si capiva che intendevi evidentemente 12.000g, ma d'altronde fosse stato qualcun altro tu non avresti mancato di farlo notare!
"Chi la fa l'aspetti!!!"
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
IL fatto che tu mi abbia messo li che per precipitare si usa ...l ambaradan,e' un protocollo,
la mia era una domanda per sapere come uscire da un guaio ,visto che in genere prima si usano i sali e poi l isopropanolo
Certo che il mio era solo un protocollo, ormai il guaio era risolto!
Se avessi letto stamattina (ma proprio non ho avuto tempo di connettermi!) la mia risposta sarebbe stata questa:
- aggiungici NaCl ad una concentrazione finale 0,3-0,5M
- il volume di Isopropanolo dovrebbe essere pari a un volume della soluzione acquosa (50% isoprop-50%H20), quindi essendo già in isopropanolo 70% va bene così!
- per aumentare la precipitazione puoi incubare a -20° almeno una decina di minuti (o più fino a o.n.)
- centrifughi (in questo caso io preferisco non sparare le centrifuga troppo elevata e non spiattellare il pellet nella provetta, tanto poi va lavato in EtOH 70%, ma anche se lo centrifughi a 12.000g va bene comunque)
- lavi in EtOH 70% (circa un volume rispetto al volume iniziale)
- ricentrifughi
- fai asciugare bene l'etanolo all'aria
- risospendi in H2O o TE
Va bene così?
Mi sembrava inutile comunque visto che ormai avevi risolto!
Ah tanto per la cronaca, non cambia niente se metti i sali prima o dopo l'isopropanolo!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2008 : 23:21:40
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no ma che,mica me la prendo
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Precipitare plasmidi in isopropanolo
Didattica
