|
neovita
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
8 Messaggi |
 Inserito il - 14 novembre 2008 : 20:08:11
|
Io ho sentito parlare dell'alfa-complementazione in relazione allo screening bianco-blu, che serve x selezionare colonie di mutanti. Ti scrivo quello che so, anche se non sono sicura di rispondere proprio alla tua domanda.
Innanzitutto serve un po' di teoria...
1) La beta-galattosidasi è un enzima che trasforma il lattosio in glucosio. L'enzima però non è specifico solo x il lattosio, ma può agire anche su composti simili, come ad esempio X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galatt... che viene idrolizzato dalla beta-gal rilasciando un composto blu.
2) La beta gal ha due domains principali, chiamati alfa e omega necessari perchè possa funzionare.
Ora, se prendi un E.Coli mutante che esprime solo il frammento omega questo non potrà idrolizzare X-Gal (o chi per esso). Se però lo trasformi con un vettore che esprima il frammento alfa, hai un fenomeno detto alfa-complementazione, per cui i due domini, anche se espressi separatamente, possono interagire e funzionare, come se avessi la beta-gal completa.
Il tipico plasmide che esprime il frammento alfa è il pUC. Il frammento è espresso sotto il controllo del promotore lac, quindi devi mettere un induttore per avere trascrizione: a tale scopo si usa di solito IPTG (isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside).
Il plasmide ha anche il gene x la resistenza all'ampicillina, per selezionare i mutanti.
Quindi, cosa succede:
hai il tuo ceppo che esprime solo omega.
1) se lo piastri su terreno con ampicillina muore tutto! 
2) se trasfetti con pUC e piastri su ampicillina ti rimarranno le colonie che hanno preso il plasmide.
3) se nel terreno, oltre all'ampicillina, ci metti anche X-Gal e IPTG le colonie saranno tutte blu.
E adesso viene il bello!
Il pUC ha il polylinker esattamente all'interno del frammento alfa. Quindi, se tu cloni qualcosa li dentro e trasfetti i tuoi bei batteriacci, poi li piastri con amp, X-Gal e IPTG vedrai:
- colonie blu che avranno il plasmide ma non il gene clonato all'interno
- colonie bianche che avranno il plasmide con il gene clonato all'interno
questo lo trovato in un forum e ti potrebbe aiutare |
 |
|
tecnologie ricombinanti
Didattica
