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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
 Inserito il - 29 gennaio 2006 : 17:44:26
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Salve!
Io sto cercando di purificare il DNA plasmidico dai batteri, per poi mandarlo a sequenziare! Seguo il protocollo di
Feliciello I. and Chinali G. "A Modified Alkaline Lysis Method for the Preparation of Highly Purified Plasmid DNA from Escherichia Coli"
perche' il mio capo e' fermamente contrario all'uso dei kit!
Ora, il problema e' che, nonostante io veda il pellet ecc.., quando faccio il gel, sorpresa, non c'e' DNA! PERCHE'? Dove me lo perdo? Risospendendo.. possibile ma poco probabile!! O forse il pellet non e' DNA... 
Qualcuno di voi ha mai usato questo tipo di protocollo? Se si, avete avuto problemi?
Io l'ho usato per la prima volta prima di natale ed ha funzionato al terzo tentativo (senza che io facessi il minimo cambiamento!!).. Sta volta anche il terzo tentativo e' fallito  !!
(Il mio capo, vedendo il mio livello di disperazione, mi ha autorizzata all'uso del kit domani, ma veramente vorrei capire dove sbaglio!!)
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Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2006 : 18:17:36
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Sembra simile a quello che seguo io tranne per l'isopropanolo al posto dell'etanolo100 (che dovrebbe fare pellet più labile, per quel che ne so) e il giro di rnasi (io risospendo in h2o e rnasi dopo secondo lavaggio in etoh70%). Se vedi il pellet mi sembra dura che non si tratti di DNA...è biancuccio-trasparentino e sorride? :)
A me viene in mente RNAsi contaminata da DNAsi (la preparate voi? Bollite ecc.ecc?), ma magari tu vedi pure il secondo pellet...oppureoppure agaroso traditore, di cui ho sentito vociferare in giro: il marker sopravvive alla corsa elettroforetica?
[col mio protocollo ho avuto un unico problema una volta, con i pellet di batteri congelati: mi è venuto fuori un eccessivo DNA genomico...risolto senza congelare i pellet per preparare esami e in caso di 48mila miniprep tenendole in ghiacchio nel passaggio di lisi e stop della lisi].
HTH |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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Rossypossy
Nuovo Arrivato
Città: Roma
17 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2006 : 22:49:13
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| Prima di mettere l'isoproponaolo, metto il cloroformio, centrifugo ed elimino il surnatante..poi passo al punto 3 del protocollo ke hai tu..Hai provato a mettere nel ghiaccio l'isopropanolo prima di usarlo?inoltre agiti bene e subito dopo averlo messo?e lo lasci mezz'ora in ghiaccio?Te lo dico perchè il mio prof dice sempre ke quello dell'isopropanolo è il passaggio più importante per l'estrazione del DNA..inoltre dopo lo precipito nell'Et-OH 80%.Per quanto riguarda l'Rnasi prima di usarla riscaladala a 60°C così eviti(in casi di contaminazioni da Dnasi)la degradazione del DNA...Cmq nn sempre è bene fidarsi dei kit,funzionano solo le preime 2 volte! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2006 : 23:40:54
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siano benedette le colonnine del kit!!!!
-even better than ever-
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Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2006 : 23:47:14
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| A dirla tutta tutta io ho sbavato ampiamente dietro a quelli che screenavano le piastre con pcr direttamente da pick della colonia...(e sudato per le bac-prep, invece, fin troppo...ne veniva fuori ma non era abbastanza per ritrasformarlo...quando ho pianto abbastanza forte per ottenere il kit commerciale han passato i bac nelle mani di una persona che non aveva anatomia da preparare...crudeltà!). |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2006 : 10:07:43
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Eh, vedo anche il secondo pellet! This is the problem! E nel gel il marker sopravvive!! Quindi non si tratta di RNasi contaminata ne, di gel simpaticone..
Dove sbaglio  ??
Comunque alla fine anche io lavo in etOH 80%!
L'ultima volta ho addirittura incubato i campioni a 60 gradi per 10 minuti.. nel caso in cui il pellet non si fosse risospeso, ma niente!!
Va beh, oggi andiamo di kit   !!
Speriamo bene va'..
Grazie mille!
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2006 : 11:07:44
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good luck!!!
-in kit we trust- |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 13:28:32
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Allora, col kit ho ottenuto il plasmide.. ma solamente in uno dei tre campioni 
Why?
Che abbiano perso il plasmide? Ma se crescevano in presenza di antibiotico !!!
I misteri della biologia.. |
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data
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 19:48:36
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Satelliti, revertanti bastardi, antibiotico messo in agar troppo caldo, tempeste elettromagnetiche...ho visto cose che voi umani non potreste immaginare dentro una piastra di petri!
(ma questo fantomatici kit, scusate l'ignoranza, han delle mini-colonnine stile quelle delle midi? Mi vedo molto bene con 48 colonnine da eluire, credo che ci metterei un giorno intero e mi ritroverei a guardare le digestioni alle 2 di notte!) |
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vale1
Utente Junior
179 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 20:39:21
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| ti consiglio vivamente il kit, risparmi tempo e fatica, vedrai, vedrai... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 20:48:31
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Citazione:
Messaggio inserito da data
Satelliti, revertanti bastardi, antibiotico messo in agar troppo caldo, tempeste elettromagnetiche...ho visto cose che voi umani non potreste immaginare dentro una piastra di petri!
(ma questo fantomatici kit, scusate l'ignoranza, han delle mini-colonnine stile quelle delle midi? Mi vedo molto bene con 48 colonnine da eluire, credo che ci metterei un giorno intero e mi ritroverei a guardare le digestioni alle 2 di notte!)
Si i kit hanno le colonnine.
Ma per fare 48 colonnine non ci metti molto, un'ora o due e via! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 21:37:32
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le colonnine del mini sono molto + piccole rispetto a quelle del midi... hanno un volume max per 800 microlitri e si accomodano in una centrifuga da banco (che è il vero fattore limitante, a livello di tempo, del numero di prep ke hai da fare).
Valia non preoccuparti è normale, capita a tutti!i miei icolai a volte crescono di straforo anche su 3 antibiotici in contemporanea! |
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Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:54:02
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Capito, grazie! Non avrò mai il kit per mini, ma non importa :)
Mi piace versarmi la bava sulle mani quando liso e stoppo...poi se le centrifughe sono limitanti il problema sarebbe quello, dacchè quelle sono in corridoio e sono comuni e una serie di altre cose...ma se non fosse così non ci sarebbe divertimento a lavorare in lab (anche se, in effetti, forse riusciremmo a produrre più risultati!). |
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Plasmid DNA preparation
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