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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
 Inserito il - 21 novembre 2008 : 15:06:24
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Ciao
Mi sono affacciato al mondo della Real time PCR da poco tempo e ho alcuni problemi di ripetibilità. In particolar modo non riesco ad avere una Ct uguale per tutti e tre i replicati di un campione. Alle volte la differenza è contenuta entro i 0,5 ma alle volte supera 1 Ct di differenza. Qualcuno mi può dare un consiglio per ridurre questa variabilità? Credo sia un problema nella preparazione della mix. Io uso la real master mix della eppendorf che è un buffer 2,5x, poi aggiungo i primer, il sybr green e l'acqua. A questo punto è meglio vortexare o pipettare per omogeneizzare la miscela? Questa è la mix per volumi grandi, poi aliquoto in altre provette e aggiungo il cDNA eqivalente per tre replicati +1. Miscelo (vortex o pipetto? e poi dispenso nella piastra.
Quindi se sbaglio dove sbaglio? Meglio pipettare o vortexare?
Grazie per la disponibilità
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 16:18:05
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| usa delle buone punte che non lascino gocce sulle pareti e sincerati che nn ci siano bolle d'aria nei pozzetti |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 16:32:12
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Ciao
Centrifugo sempre prima di caricare la piastra sul termociclatore, quindi non è un problema di bolle. I puntali li ho già cambiati e ora uso i low retention della axigen. Non sono i migliri in circolazione ma sono sicuramente meglio dei puntali tradizionali. Tu cosa mi consigli per quanto riguarda la miscelazione? Meglio vortexare o pipettare?
Grazie |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 16:35:57
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| sinceramente non credo ci sia una gran differenza tra le due opzioni, a mio parere la cosa migliore é assicurarsi una pipettata nelle piastre più precisa possibile |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 19:32:33
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Prova a pulire i pozzetti del macchinario prima dell'uso. Nel software dei macchinari AB se non erro c'è anche un tool che ti fa vedere se sono sporchi.
Inoltre, cambi puntale dopo per OGNI pozzetto? anche se stai mettendo la stessa cosa?
Perchè soprattutto per volumi piccoli può essere un problema. (io avevo questo problema nei dosaggi proteici. Cambiando puntali ogni volta riuscivo a volte anche ad avere replicati perfettamente identici, ma se non li cambiavo erano anche molto diversi) |
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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 09:59:25
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Ciao
la macchina funziona bene, sono quasi sicuro che il problema è mio. Non sono proprio un novellino, faccio pcr da un sacco di anni, però ho dei problemi con la ripetibilità dei triplicati con la real time. I puntali sono low retention e li cambio sempre. Ho letto in un forum che il puntale deve appena entrare nella mix non immergerlo completamente. Posso essere anche d'accordo, ma allora per miscelare la mix una volta aggiunto il cDNA come faccio??? Se vortexo rimane un pò di liquido sulle pareti, se pipetto rimane un pò di liquido sulle pareti esterne del puntale. Io non ho ancora capito se il mio problema è nella fase finale cioè quando dispenso i campioni nella piastra o se è un problema a monte in fase di preparazione della mix. Chi fa real time da un sacco di tempo mi può dire come prepara la mastermix? e quali consigli mi date?
Grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 10:16:12
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Guarda, io non faccio realtime da qualche anno, quindi non so dirti.
Ma altre persone che usano quel macchinario hanno lo stesso problema? |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2008 : 11:30:50
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Non penso siano problemi di master o mix in generale (perchè in quel caso tutti e 3 avrebbero gli stessi problemi). Penso invece che siano problemi di solubilità del DNA. Quello che posso consigliarti è di vortexare a fondo. Hai notato se per caso usando DNA + vecchio i risultati sono più riproducibili? Prova con il vortex a massima potenza per 5-6 secondi prima di mettere su piastra, poi pipetta 4-5 volte stando sul fondo della provetta e non sulla superficie (solitamente si sta sulla superficie quando si fanno diluizioni), naturalmente dispensa nei pozzetti di lato e non direttamente sul fondo così non incidi con eventuale DNA rimasto appiccicato all'esterno del puntale. Per il discorso cambio di puntali non ho mai notato differenze (e uso puntali molto scadenti, per lo + storti appena escono dal rack  ), ma se vuoi provaci pure. Puoi anche vedere se è sempre lo stesso replicato a uscire diveramente dagli altri, magari il primo piuttosto che il terzo, giusto per vedere se è un tuo problema o una cosa casuale. |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2008 : 14:38:06
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Fammi capire una cosa cece, tu prepari la mix,la aliquoti eppoi cosa fai? Una di queste aliquote ti serve per dispensarla nei vari pozzetti della tua piastra eppoi ci metti il tuo cDNA?
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Ignacio Celestino
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2008 : 18:09:40
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| Guarda io una volta che ho preparato la mix la vortezzo dopo di che la spino con l mini-centrifuga. Dopo metto il volume necessario per il triplicato in una eppendorf da 0,5, poi ci metto il cDNA, senza spipetare tanto il volume è piccolo. Invece spipeto bene sempre questa epp da 0,5 quando devo prendere 25 ul per caricare il triplicato sulla piastra. |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 12:12:17
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Cece e Ignacio Celestino siete la stessa persona? A giudicare dalla risposta direi di sì.
Se sei tu , è la prima volta che sento fare il caricamento di una piastra nella maniera che mi descrivi, da anni noi, come penso tutto il mondo da me conosciuto, prepariamo la mix con un volume tale per un tot di pozzetti, mettendoci il syber ed i primers, vortexiamo e spinniamo, quindi dispensiamo nei pozzetti , solo a questo punto viene messo il cDNA ( anzi, prima si seminano le acque, poi i campioni) avendo l'accortezza di cambiare il puntale per ogni pipettata di campione, anche se è lo stesso campione ( come diceva chick). Solo per la dispensazione della mix nei pozzetti puoi usare la stessa punta. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 15:16:57
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Citazione:
Messaggio inserito da cin
... è la prima volta che sento fare il caricamento di una piastra nella maniera che mi descrivi, da anni noi, come penso tutto il mondo da me conosciuto,...
Cin io faccio parte del mondo a te sconosciuto!!!
Ho sempre fatto esattamente come ha detto Ignacio Celestino!
Il fatto è che in questo modo i replicati sono "esattamente" replicati della stessa cosa, dalla stessa mix+cDNA semini nei 3 pozzetti.
Se tu aggiungi il cDNA dopo direttamente nella piastra ci possono essere delle variazioni della quantità di cDNA che metti nei tre pozzetti.
E' più macchinoso e dispendioso di tempo, ma "in teoria" più accurato.
Poi non voglio di certo dire che con l'altro metodo non sia giusto!
L'unica cosa che faccio di diverso è che vortexo bene anche le provette da 0,5 con mix+cDNA, non le sto a spinnare tutte (non finirei più) tanto le preparo con un 10% in più.
Non ho mai avuto grossi problemi di ripetibilità tra i vari replicati, a parte qualche pozzetto che ogni tanto riesce male, ma è del tutto casuale. Non so sinceramente dove possa essere il problema.
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 16:22:18
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| In effetti anche io faccio parte di quel mondo sconosciuto e come GFPina benedico quel +10% |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 20:05:27
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Io farei una considerazione che non ho ancora letto qui nel forum...
1 Ct di differenza equivale a circa il doppio di campione, ovvero una quantità estremamente alta per la differenza!
Non credo ad un errore di pipettamento a meno ché non si pipettano 0,5 ul di cDNA, allora sì che basta un'ombra in più per arrivare al doppio dell'amplificato, quindi il pipettamento è relativo ad errori < 1 DeltaCt se si lavora bene.
Per quanto riguarda il volume totale, è ovvio che una differenza di 2 volte tanto in volume possa essere visto direttamente ad occhio. Quindi anche l'errore di pipettamento del volume totale non possa arrivare addirittura ad 1 Ct di differenza.
Una grossa differenza invece è la fluorescenza di base del vano dove metti la piastra...
All'inizio delle mie Real Time avevo un problema simile, ma la variazione era spesso maggiore di 1 Ct tra i triplicati, mentre ad un mio collega che usava la stessa macchina non capitava.
Ebbi il primo dubbio sul fatto che mettendo i triplicati in senso verticale anzicché orizzontale la variazione era sostanzialmente ridotta in alcune file, mentre in altre si manteneva alta.
Vidi la fluorescenza di base e praticamente tutti i pozzetti erano + o - fluorescenti con rapporti variabili.
Taratura->Corsa-> Risultato ottimo, quindi pulizia di base dello strumento e Ritaratura.
P.S.: il mio collega usava il VIC o FAM che emetteva la fluorescenza in un'altra lunghezza d'onda, quindi acquisiva con un altro filtro... In quel filtro lo sporco della piastra non emetteva alcuna fluorescenza...
Per evitare una serie di problemi, soprattutto quelli della pipetta, io diluisco da 1:10 fino a 1:400 il mio cDNA con un aumento dei Ct da 3 (es 25->28) fino a 9 (es 25->34) (scelgo in base all'abbondanza del cDNA)
Ovvio che prendere 10 ul di cDNA così diluito e mixarli con 10 ul di master mix real time 2x si sbaglia di meno rispetto a prendere 0,5 ul di cDNA concentrato ogni volta.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 22:41:02
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In effetti io la calibrazione dello strumento la davo per scontata! 
Riguardo alla diluizione del cDNA concordo in pieno anche io lo faccio!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 22:49:34
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| Beh, ma sai, l'idea è che quando uno finisce di usare lo strumento lo pulisce. Poi la pratica è che te lo devi pulire tu dalle schifezze degli altri quando lo vai a usare... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 23:04:51
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Beh, ma sai, l'idea è che quando uno finisce di usare lo strumento lo pulisce. Poi la pratica è che te lo devi pulire tu dalle schifezze degli altri quando lo vai a usare...
Eee hai ragione... ma io ne ho uno tutto per me!  |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 00:23:49
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Era quello a cui mi riferivo quando suggerivo di pulire i pozzetti. :)
Bhé, in effetti rileggendo quello che ho scritto, mi sa che ho tagliato inavvertitamente una metà del post in cui, tra le altre cose, ti davo ragione...
spesso sono così tanto prolisso che scrivo in pochi secondi pagine di inutili cavolate, e poi passo decine di minuti per cercare di riassumere tagliando il 90-95% (a volte di più) di quello che scrivo e rimodellarlo in un italiano comprensibile.
Questa volta per la fretta ho tagliato una parte di quello che ho scritto e poi mi sono dimenticato di reincollarla nel posto giusto, anche per questo il mio post è un po' confuso e sconclusionato.
Nella parte che ho cancellato, anche dalla mia memoria, davo ragione a chick e GFPina, poi dispensavo inutili consigli già ovvi e stra-citati da altri, oltre che fare una serie di considerazioni personali punto per punto su quanto possono influire determinati errori sul Ct... ma forse il post già è già lungo di per sé senza questa regione maltagliata.
Le uniche 2 cose che forse valgono la pena di citare sono
1) pulizia delle pipette in NaOH 0,1 N + SDS 1% prima degli esperimenti di real-time
2) non sono d'accordo sul fatto di fare un 10% in più, specie se non lo misuri con la pipetta alla fine. E' ottimo per controllare errori di pipettamento
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 09:41:34
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Neuroscience per quanto si è precisi e si abbiano pipette iper tarate, capita sempre che un pò perchè sei scazzato e maltratti il campione, un pò perchè il campione è scazzato e ti fa i dispetti, un pò perchè hai il pollo nel forno...si arriva all'ultimo replicato e manca del materiale!!! Quel 10% in più non aggiunge nessun tipo di errore (ma anzi...visto che prendi un pò più di materiale). E' lo stesso concetto per cui si prepara più mix per non rimanere all'ultimo tubo impiccati (più volume, ma uguale concentrazzione).
Il ragionamento del controllo ci sta pure, ma dopo 2 ore di spipettamenti vari che il pollice è grande come un'arancia, ti sfido a perderne un'altra per controllare tutti gli avanzi...e poi per cosa...per farsi del male?  ? |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 11:52:52
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Mi sa che a questo punto il mondo sconosciuto è il nostro e non ne dubiterei...
Bello però che emergano queste cose, molto interessanti, quando tornerò a fare real proverò anch'io il vostro metodo.
GFPina, ma per la standard fai la stessa cosa che per i campioni? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 16:13:24
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Citazione:
Messaggio inserito da cin
br]...Bello però che emergano queste cose, molto interessanti,
Si è vero non si finisce mai di imparare cose nuove! E' bello confrontare i protocolli!
Citazione:
GFPina, ma per la standard fai la stessa cosa che per i campioni?
Non uso molto la curva standard, comunque si il trattamento è uguale per tutti!
Concordo appieno con marok, in più senza quel 10% dovresti centrifugare di continuo per recuperare il tutto, anche perchè alla terza pipettata dalla stessa provetta è quasi impossibile non fare bolle, quindi l'ultimo replicato sarebbe compromesso! e poi se ti accorgi che ne manca un po' che fai? |
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Discussione |
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preparare mix per real time
Didattica
