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andrea78
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 22 novembre 2008 : 23:15:54

Chi mi saprebbe spiegare bene la differenza di una curva standard per quantificazione relativa rispetto ad una curva standard per quantificazione assoluta nella real-time PCR

marok
Utente Junior

150 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2008 : 10:13:56

La curva per quantificazione assoluta si fa attraverso uno standard di cui conosci esattamente il numero di copie ad es: hai una soluzione stock che contiene 10^6 copie di bersaglio. Fai le relative diluizioni e il tuo campione può essere esattamente quantificato. Invece per la quantificazione relativa la tua curva la fai con uno standard di cui conosci solitamente la % di sequenza bersaglio rispetto a quelle totali per cui facendo una quantificazione avrai una percentuale sul totale e non una quantità assoluta.

andrea78
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2008 : 00:30:20

Citazione:
Messaggio inserito da marok

La curva per quantificazione assoluta si fa attraverso uno standard di cui conosci esattamente il numero di copie ad es: hai una soluzione stock che contiene 10^6 copie di bersaglio. Fai le relative diluizioni e il tuo campione può essere esattamente quantificato. Invece per la quantificazione relativa la tua curva la fai con uno standard di cui conosci solitamente la % di sequenza bersaglio rispetto a quelle totali per cui facendo una quantificazione avrai una percentuale sul totale e non una quantità assoluta.

Grazie per la risposta..Ok per la assoluta va bene.. ma per la relativa.. come faccio a sapere dello standard quale è la sua % rispetto al totale e poter così costruire la curva?.. da quanto intendo dovrei partire da diluizioni di cDNA preparato dall'RNA totale, amplificare il mio target con la real-time PCR e mettere in relazione il Ct ottenuto con il quantitativo di cDNA utilizzato?

marok
Utente Junior

150 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2008 : 13:18:00

Quello era un esempio che credo non valga per gli studi di espressione. Comunque gli standard a % note si comprano

. Per lo studio di espressione devi normalizzare i tuoi dati con un gene endogeno che ne so ad esempio l'actina, che sai che non varia tra la condizione di controllo e quella del trattato. Utilizzi una curva fatta con l'actina (es con plasmidi al cui interno hai clonato il gene), poi fai una real-time sia per l'actina che per il gene di interesse sia nelle condizioni di trattato che di controllo e così puoi dire di quante volte il tuo gene di interesse ha aumentato o diminuito l'espressione usando come normalizzatore l'actina.
Questo era solo un esempio ipotetico perchè ci sono varie strategie per le quantificazioni relative che dipendono da cosa vuoi quantificare (ad esempio io non mi occupo di studi di espressione e utilizzo un metodo che richiede due curve standard).
Se non sono stato chiaro o hai altre domande chiedi pure.

farmacologia
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2009 : 06:59:17

Dallo schema sotto riportato posso immaginare che si tratti di una Real Time assoluta?
E in parole molto povere, cosa farà la real time?
qui le curve standard sono due: uno per il gene target e l'altra per l'Hk.
Di che tipo di tecnica si tratta?

Immagine:

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