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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
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 Inserito il - 04 dicembre 2008 : 15:15:08
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Si,e' il campione che viene messo in presenza di urea 9M, CHAPS 4%, Tris 40mM, DTT 65mM,ovviamente la preparazione puo' variare in base al tipo di campione prelevato,nel senso che se e' un estratto da sangue sara' piu' ricco di proteine come ad esempio l albumina ed il trattamento potrebbe variare,
per quanto riguarda le strip della prima dimensione si comprano gia' fatte non credo che nessuno si cimenta a farle
Blu-native page non e' la seconda dimensione,sono due cose distinte..l isoelettrofucusing e' una metodica diversa dalla Blu-native,
nella blu native Il gel della prima dimensione è preparato usando un buffer a base di acido amino-caproico1,5M e Bis-Tris 150mM a pH7,la carica negativa che spinge le proteine verso l’anodo non è data dall’SDS, bensì dal Serva Blue G (CoomassieG-250), che permette dicaricare le proteine senza denaturarle! La separazione avviene esclusivamente in funzione della loro massa e forma.
Ti faccio un esempio attinenente a questo tipo di tecnica:
vuoi vedere quante proteine formano un complesso della catena respiratoria
1) farai un primo gel in gradiente di poliaclilammide in maniera tale che i complessi si separino in base alla loro massa e struttura,in maniera tale che le proteine piccole monomeriche migreranno piu' velocemente verso l anodo rispetto a quelle a piu' alto peso molecolare oppure ai complessi multiproteici,
1)a questo punto farai la seconda dimensione con un gel che e' fatto in condizioni denaturanti e le tue proteine migrano perpendicolarmente al primo gel e in condizioni denaturanti con SDS tutte le subunita' si dissociano e i singoli monomeri possono migrare in base alla loro massa come un normale SDSpage
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