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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2004 : 16:21:28
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Qualcuno sa spiegarmi la differenza tra eluizione isocratica e di gradiente nella cromatografia a forza ionica?inoltre non capisco il concetto di piatto teorico(N) e di tempo di ritenzione.Come funziona il cromatogramma?Infine nella tecnica della Gel filtrazione su che parametri si basa la curva di selettività?PER FAVORE QUALCUNO MI AIUTI!!!!HO L'ESAME DI BIOCHIMICA TRA UNA SETTIMANA E SONO IN ALTO MARE!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2004 : 16:44:31
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Allora, un punto alla volta:
1) la differenza tra isocratica e gradiente, che non sono usate solo x la cromatografia a forza ionica, ma x qualsiasi cromatografia, (anche HPLC) è la fase mobile che usi.
Nell'isocratica usi un solo composto come fase mobile, mentre in quella a gradiente usi due o più solventi miscelati in % diverse nel tempo (es. inizi con acqua e acetonitrile 1:2 e termini con gli stessi ma 1:5).
Di solito non si usano più di due solventi perchè è un casino definire bene come modificare il gradiente, ed inoltre il detector potrebbe rilevare variazioni passando da un solvente all'altro e questo ti darebbe inaccuratezza nei risultati.
La scelta della fase mobile e del fatto di lavorare in isocratica o in gradiente è assolutamente dipendente da cosa devi separare e da che colonna usi, solitamente non puoi fare previsioni esatte, si prova e si vede cosa funziona meglio.
2) Il tempo di ritenzione è semplicemente il tempo necessario all'analita x uscire dalla colonna e dipende, tra l'altro, dalla sua affinità per la fase stazionaria.
3) Il concetto di piatto teorico è un po' + ostico... anche perchè è abbastanza astratto.
In pratica immagina che la colonna sia divisa in tante fette, abbastanza grandi da permettere al campione che stai separando di entrare in equilibrio tra fase stazionaria e fase mobile, prima di passare alla *fetta* successiva. Ecco, quello è un piatto teorico! Maggiore è il numero di piatti teorici, e quindi più piccola è l'altezza del piatto (HETP = lunghezza colonna / numero dei piatti), tanto più strette e risolte saranno le bande del campione.
Se immagini che la colonna sia divisa in 3 piatti teorici, avresti il tuo campione distribuito, ad es. tanto in quello centrale e poi di meno nei 2 adiacenti... questa situazione sarebbe terribile, perchè il campione sarebbe su tutta la colonna!
Se invece consideri 100 piatti teorici, e il campione principalmente in 1 piatto e sempre di meno nelle zone adiacenti vedrai che la concentraz. di campione va a formare una gaussiana molto + stretta.
Una colonna commerciale in media ha N > 10^8, ma N è un parametro che dipende anche dal campione (quindi la stessa colonna può avere N diversi x due diversi campioni).
Ovviamente il processo di ripartizione è un qualcosa di continuo e la colonna non è divisa in pezzi...
4) Il cromatogramma ti fa vedere la risposta del detector al passare del tempo.
Ad es. se hai una colonna con un detector UV che legge a 280nm (x vedere le proteine), vedrai una linea di base sempre, e poi, quando una proteina eluisce dalla colonna, un picco, di area e altezza proporzionali alla quantità di proteina e che esce al tempo di ritenzione della proteina stessa.
5) La curva di selettività non so cosa sia, ma la gel filtrazione essenzialmente separa per massa e parametri sterici (forma/ingombro della molecola).
Wow! Ho risposto a tutte le domande!!! (in realtà ho appena fatto l'esame di "analisi dei farmaci biotek" e quindi mi ricordo ancora bene queste cose...).
In bocca al lupo x l'esame!!!
nICO
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2004 : 13:35:39
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Crepi il lupo!!grazie sei un pozzo di sapienza.Tieni sotto controllo il forum in caso mi vengano altri dubbi!
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2004 : 08:21:38
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Froza chick!!
Sei una colonna portante e fondamentale di questo forum!!
Naturalmente grazie.
Riky
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Molecularlab.it Animazioni, e didattica su bioinformatica, biologia molecolare ed ingegneria genetica.
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Storia Personale di un Piccolo Scienziato Pazzo
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2004 : 20:05:02
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Ciao Chick.Mi descriveresti come avviene una HPLC?Sai anche dirmi come si effettua un'analisi quantitativa utilizzando sia un cromatogramma che uno spettro di massa?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2004 : 10:38:29
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Ok, ci provo... conta che non ho mai fatto un HPLC in vita mia, quindi ci potrebbe essere qualche imprecisione!
Essenzialmente l'HPLC è molto simile ad una normale cromatografia su colonna, ma ti dà risoluzione molto più alta.
Il sistema consiste di una colonna di 15-20 cm di lunghezza di acciaio inox, che è impaccata con una fase stazionaria costituita da microparticelle (dell'ordine dei 10-20 micron di diametro). L'uso di particelle così piccole garantisce un impaccamento perfetto ed una velocissima ripartizione del campione tra fase stazionaria e fase mobile, poichè aumenta molto la superficie di contatto, aumentando quindi il numero di piatti teorici. Tuttavia, lo svantaggio è che particelle così piccole danno anche una fortissima resistenza allo scorrimento della fase mobile, quindi bisogna lavorare a pressioni molto elevate, con tutti i problemi che ne derivano...
Visto che è necessario usare colonne così piccole, a causa delle alte pressioni, l'HPLC è essenzialmente uno strumento analitico e non viene usata come strumento preparativo.
La fase mobile viene fatta scorrere in automatico da un sistema di pompe che prendono il solvente o i solventi, se lavori in gradiente, da appositi contenitori.
A monte della colonna è anche presente un sistema per l'introduzione del campione che ti permette di iniettare quantità molto precise dello stesso (di solito si parla di 10-20 microlitri).
Sempre prima della colonna sono anche solitamente presenti una colonna di condizionamento ed una precolonna.
La colonna di condizionamento è una colonnina riempita di silice che serve per saturare di silice la fase mobile, che potrebbe essere troppo aggressiva nei confronti della fase stazionaria della colonna. La precolonna, invece è un piccolo segmento di colonna impaccata allo stesso modo della colonna analitica che serve essenzialmente per trattenere particelle molto grosse e schifezze varie che potrebbero rovinare la colonna analitica.
A valle della colonna c'è poi un raccoglitore di frazioni e un rivelatore (che può essere spettrofotometrico, spettrofluorimetrico, amperometrico, a indice di rifrazione etc. etc. etc.) e che analizza l'eluito al passare del tempo, passando i dati ad un computer che ti dà il cromatogramma.
Per quanto riguarda l'analisi quantitativa, l'area sotto ciascun picco (AUC) è proporzionale alla quantità di sostanza presente, quindi coiniettando uno standard a titolo noto nella colonna (standard interno) si possono riferire le aree a quella dello std e derivare quindi la quantità dei vari analiti.
In realtà anche l'altezza del picco è proporzionale alla quantità di sostanza, ma la relazione è meno precisa.
Per quanto riguarda gli spettri di massa, sinceramente non ti so aiutare... se non ricordo male anche in quel caso l'altezza del picco è proporzionale alla quantità di sostanza, ma non ne sono sicurissimo...
nICO
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2004 : 20:16:01
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Grazie chick e scusa per il disturbo,mi sei stato di grande aiuto.
 Sara
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mimì
Nuovo Arrivato
Città: milano
28 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2004 : 00:32:08
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Peccato essere stata assente così tanto dal forum...in fondo il mio lavoro è usare HPLC quindi ti avrei potuto aiutare...ma ho visto che chick80 è un vero genio e mi sa che nonostante tutta la mia buona volontà non sarei riuscita a spiegarti le cose meglio...se ti può ancora servire posso darti qualche informazione sull'analisi quantitativa con HPLC-massa ( anche se io uso di solito HPLC_UV). In realtà la massa è usata come rivelatore principale della gas cromatografia perchè entrambi gli strumenti analizzano i campioni in fase gassosa, hanno livelli di sensibilità (per sensibilità s'intende la capacità dello strumento di riconoscere una determinata sostanza in determinate quantità)paragonabili ed operano in intervalli di temperatura simili.
Il principio su cui si basa la massa è quello di rompere per mezzo di un fascio di elettroni la molecola analizzata, il movimento degli ioni, così generati,attraverso campi elettrici o magnetici fa in modo che questi ioni si separino in funzione del loro rapporto massa/carica.Lo sprettro di massa è quindi un diagramma che rappresenta le quantità relative di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica.
L'analisi quantitativa viene solitamente effettuata tramite il metodo della "predizione inversa", cioè s'utilizza un opportuno standard interno che viene aggiunto alle quantità note e scalari di sostanza incognita e si costruisce una curva di calibrazione.
Si andranno poi ad analizzare i composti a quantità incognita e si costruirà una curva di regressione in modo tale da mettere in relazione i rapporti delle intensità ioniche del composto in esame rispetto allo standard interno con le concentrazioni degli standard di calibrazione.
Sembra un casino ma non lo è ...in fondo una volta capito cos'è una curva di calibrazione ( che è semplicemente un grafico dei rapporti delle risposte rispetto alla quantità o concentrazione dell'analita )è semplice paragonare tutti i risultati ottenuti a questa.
Io personalmente ho fatto solo analisi qualitative con massa ma la teoria è quella che ti ho scritto sopra...se ti serve qualcosa di più specifico fammi sapere che di materiale ne ho.
Per quanto riguarda la selettività non ho mai sentito parlare di curva di selettività,ma in teoria la selettività è indice della capacità dello strumento di separare due o più analiti diversi. In HPLC è un numero dato dal rapporto tra i fattori di ritenzione non è una curva!
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2004 : 14:03:36
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Grazie mimì mi hai dato ulteriori chiarimenti.Spero di arrivare anche io un giorno ai vostri livelli.
Ciao
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mimì
Nuovo Arrivato
Città: milano
28 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2004 : 20:23:29
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Figurati è un piacere...spero per te che tu possa arrivare a livelli molto più alti dei miei!!!!!! Bisogna sempre puntare in alto !
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
 Inserito il - 12 luglio 2008 : 19:06:31
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ho cercato sul forum se per caso avevate già parlato di piatti teorici e mi è venuta fuori questa discussione un pò vecchiotta.. Però io continuo a non capire..Sto pensando di imparare le definizioni a memoria 
Ho capito solo cos'è un piatto teorico, ma non risco a capirne la relazione col profilo di eluizione, come la sua alteza possa darmi informazioni sulla risoluzione 
Uff, sono negata per queste cose  |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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frau_frosch
Utente Junior
Città: Boston
225 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 13:04:30
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Fermo restando che ovviamente, per una colonna di una data lunghezza, maggiore è il numero di piatti e minore sarà l'altezza di ciascun piatto, provo ad approfondire la spiegazione di chick80.
Prima di tutto cercodi spiegarti intuitivamente la situazione. ipotizza di avere un soluto che si distribuisce tra fase stazionaria e fase mobile con un rapporto 4:6 e di porre 100 moli del soluto in una colonna con 3 piatti teorici.Vediamo che succede:
1°piatto: il soluto si distribuisce 4:6 per cui 40moli restano e 60 fluiscono via verso il secondo piatto;
2°piatto: arrivano 60 moli. per lo stesso principio 24 moli restano e 36 fluiscono.
3°piatto: restano 14.4 moli. il resto abbandona la colonna.
Quindi la situazione risulta questa: 40 - 24 - 14.4 moli.
Ora però considera una cosa: nel primo piattole 40 moli restanti sono all'equilibrio solo nell'istante in cui avviene la ripartizione. Il problema è la situazione non è statica, perchè prima di tutto le 60 moli vanno via e poi perchè nel frattempo continua ad arrivare fase mobile in cui il soluto non c'è più. Di fatto, quindi, è come se lentamente la concentrazione di soluto nella fase mobile del primo piatto si diluisca sempre più.
Ora per semplificare immaginiamo che tutti questi "movimenti" avvengano in modo molto rapido e che quindi, in un istante, da avere la situazione di equilibrio 40 moli in fase staz e 60 in fase mobile, abbiamo ancora 40 moli in fase staz e nessuna in fase mobile.
Questa situazione equivale ad un piatto vuoto in cui siano stati inserite 40 moli. Per cui, di queste 40, 16 restano in fase stazionaria nel primo piatto e 24 passano al secondo piatto.
Nel secondo piatto abbiamo la stessa situazione: avevamo 24 moli, ma non erano più in equilibrio, per cui nello stesso istante in cui le 40 moli del primo piatto si sono ridistribuite nel primo piatto, nel secondo le 24 moli iniziali si ridistribuiscono e di esse 9.6 restano nel secondo piatto e 14.4 vanno al terzo. Quelle 9.6 moli però si sommano alle 24 arrivate dal primo piatto. Al netto nel secondo piatto restano 9.6+24= 33.6moli.
Stesso discorso nel terzo piatto: delle 14.4 moli iniziali, 5.76 restano e il resto fuoriesce dalla colonna. 5.76moli+14.4che arrivano dal secondo piatto=20.16
Al "secondo istante" la situazione quindi diventa= 16 - 33.6 - 20.16
Ovviamente gli "istanti" continuano..ma come vedi abbiamo già formato una piccola "campana" e solo con 3 piatti!
Come migliora la situazione con più piatti? in generale hai potuto vedere che la formazione del "picco" è dovuta a quel rimescolamento tra fasi e al fluire della fase mobile. se avessimo considerato un terzo "istante", il picco sarebbe risultato ancora più evidente. Il problema è che man mano che gli "istanti" passano, ossia man mano che il picco si crea, il soluto eluisce dalla colonna.
Per cui avendo 3 soli piatti, non potrai avere un numero di equilibri infinito: arriverà un punto in cui tutto il soluto sarà eluito via, e a quel punto i giochi son fatti e non si può più migliorare l'effetto picco. Se però hai un numero di piatti maggiore, intuitivamente puoi capire che è come se potessi instaurare più equilibri, per cui quella "risoluzione massima" sarà maggiore che nel primo caso.
...Mi scuso solennemente con tutti gli utenti del forum per questa variopinta descrizione della cromatografia (che spero sia comunque servita)...
Detto questo cerco di farti capire in maniera più "seria" come vanno le cose:
Man mano che procede il flusso di fase mobile, il tuo soluto non procede come un blocco unico che si muove, ma tende a formare un picco che sarà sempre più largo a seconda di diversi parametri:
- DIFFUSIONE LONGITUDINALE: come una goccia di inchiostro si rimescola in un bicchiere d'acqua, così fa il tuo soluto. Sul piano trasversale questo ti interessa poco ma su quello longitudinale ti causa l'allargamento di banda. Questa componente dipende in massima parte dal coefficiente di diffusione della fase mobile;
- IMPACCAMENTO della colonna: maggiore è l'impaccamento, più il soluto ha difficoltà ad eluire, per cui questa resistenza lo spinge a cercare percorsi "tortuosi"
- RESISTENZA AL TRASFERIMENTO DI MASSA: la fase stazionaria oppone resistenza allo psostamento del soluto: più essa è spessa e minore è il suo coefficiente di diffusione, maggiore sarà tale resistenza.
Ora, tutti questi fattori che "allargano la banda" e quindi diminuiscono la resistenza vengono quantificati (esiste una bella formuletta per ognuno, che ti risparmio!). Sommando i tre valori, ottieni un numero che non è altro se non l'altezza di un singolo piatto.
Quindi tale altezza è correlata alla risoluzione; questo vuol dire che per una colonna lunga L il numero di piatti (L/altezza) è correlato alla risoluzione.
Spero ti sia tutto più chiaro ora! |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 14:47:51
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Innanzitutto, frau_frosch, ti ringrazio per la gigantesca pazienza nello scrivere tutto questo
Sommando la vecchia spiegazione di Chick, la tua -dettagliatissima- e le formule sulle slide della prof(hehe, io non me le sono risparmiate: ho una certa propensione a capire le teorie più con le formule che con le parole  ) mi sembra di avere vari concetti più chiari...
Grazie mille ancora!!!! |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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frau_frosch
Utente Junior
Città: Boston
225 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 16:07:46
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Prego...e comunque fai bene a guardare le formule! anche a me sembra che a volte spieghino i concetti meglio delle spiegazioni dei prof! o almeno quelle di alcuni di loro |
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meme
Nuovo Arrivato
Città: roma
46 Messaggi |
Inserito il - 28 dicembre 2010 : 17:46:03
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| Ciao Ragazzi avete delle informazioni sull'analisi quantitativa con HPLC-massa e HPLC_UV.Vi ringrazio in anticipo |
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