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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2004 : 16:22:48
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Qualcuno sa spiegarmi il ciclo soglia?
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2004 : 08:19:51
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La curva di amplificazione di un prodotto PCR è solo teoricamente esponenziale, ma in realtà, dopo la prima fase, assume un andamento rettilineo che progressivamente raggiunge un valore massimo al quale tendono tutti i campioni, a prescindere dalla quantità di DNA di partenza.
Nello studio di un grafico di PCR vengono definiti tre parametri:
• La linea base della fluorescenza, che indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato;
• La linea soglia, parallela alla linea base, scelta dall’operatore in maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale;
• Il ciclo soglia, specifico per ogni campione, identifica il valore del ciclo di PCR in cui la curva in fase esponenziale interseca la linea soglia (in sostanza è il ciclo in cui la fluorescenza è statisticamente significativa sopra il background).
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2004 : 13:33:33
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Grazie mille
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2004 : 18:59:53
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Ovviamente si sta parlando di real-time PCR, perchè nella PCR normale analizzi il campione con l'elettroforesi quando ormai sia la fase esponenziale che quella lineare sono finite e sei già a plateau.
nICO
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Sara82
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
24 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2004 : 20:00:08
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Sempre per quanto riguarda la PCR, a lezione si è parlato di "taqman".Qualcuno ne sa qualcosa?Inoltre come avviene un saggio di conversione genetica per mezzo di housekeeping?
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Micotossicologo
Nuovo Arrivato
Prov.: Mantova
4 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2004 : 23:39:23
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Mi ricordo qualcosa riguardo ad una sonda TAQMAN che si usa nella Real-Time PCR.
Ti scrivo tutto quello che so:
La PCR si basa sull’impiego di un enzima, la Taq Polimerasi, che catalizza la reazione di amplificazione in vitro di una particolare sequenza di DNA a partire da una frazione di acido nucleico che viene utilizzato come stampo. Nel caso della Real Time PCR è anche possibile monitorare l’andamento della reazione mentre è ancora in svolgimento ed i dati che si ottengono a fine ciclo si possono utilizzare per effettuare una quantificazione relativa del frammento amplificato. Questo è possibile tramite l’impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione PCR. La fluorescenza emessa in seguito ad uno specifico irraggiamento da parte della sorgente luminosa del termociclatore viene quindi misurata in tempo reale da una telecamera CCD. Tutti le operazioni relative alle misurazioni avvengono sotto il controllo di un software gestito da personal computer. La Real Time PCR si può realizzare mediante l’impiego di coloranti intercalanti (es.SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA, oppure con sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento amplificato del transgene ricercato, marcate con molecole fluorescenti. Esistono diverse tipologie di sonde tra queste le sonde TaqMan.
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio del transgene da amplificare. Presenta all’estremità 5’ unfluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”.In una configurazione di questo tipo la molecola “Quencher” impedisce l’emissione di fluorescenza da parte del “Reporter”: Nel corso di ogni ciclo di PCR, nella fase di estensione del filamento di DNA complementare alla sequenza bersaglio, quando l’enzima Taq Polimerasi incontra l’estremità5’ della sonda effettua il distacco del “Reporter”. In questo modo il fluoroforo va in soluzione, non subisce più l’inibizione del“Quencher” ed emette fluorescenza. In base a questo meccanismo l’intensità della fluorescenza aumenta in funzione della concentrazione dell’amplificato specifico della reazione.
Simone
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2004 : 09:49:22
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Una piccola precisazione sui diversi tipi di approccio alla real-time.
L'uso del SYBR Green è consigliato solo nel caso in cui si abbiano dei primer molto specifici, in quanto il SYBR Green è assolutamente aspecifico (intercala tutto il DNAds). Inoltre in questo caso è praticamente indispensabile fare una curva di taratura usando campioni di DNA a diluizioni successive.
Le sonde Taqman, invece, hanno di buono che avendo un sistema a 3 (2 primer + la sonda) danno una selezione praticamente perfetta solo per il gene di interesse. Tuttavia presentano il problema di un maggior costo e possono dare problemi di bassa incorporazione se la sequenza non è scelta in modo ottimale.
Esistono inoltre altri approcci:
- Il metodo BD QZyme (non so se anche altre aziende oltre alla BD fanno prodotti simili) che in pratica usa una sonda unica per tutti i geni, che lega una specifica sequenza da inserire a monte del primer 5'.
- Un altro metodo, di cui non ricordo il nome, se non sbaglio distribuito da Invitrogen, che usa primer marcati con un fluoroforo. Questo fluoroforo può intercalare il DNA ed emettere fluorescenza, ma ovviamente lo fa solo quando il primer si è legato al gene ed è quindi stato amplificato.
Per quanto riguarda l'uso degli housekeeping, essenzialmente è quello che ti permette di avere dati quantitativi.
In pratica si sceglie un gene housekeeping (come il 18S, che è espresso in modo costante in tutte le cellule) e nella miscela di reazione, oltre a primer e sonda del gene di interesse, si mettono anche quelli del 18S. In questo modo tutti i dati sono riferiti al 18S. In particolare si calcola il delta-Ct (Ct = cycle treshold, cioè ciclo soglia), cioè la differenza tra i cicli soglia del tuo gene e del 18S.
A questo punto si possono riferire tutti i delta-Ct al delta-Ct di un campione di riferimento, ottenendo così dei delta-delta-Ct, che ti servono poi per l'analisi quantitativa.
nICO
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