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pulce.wb
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 15 dicembre 2008 : 10:48:28
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ciao a tutti,mi scuso in snticipo se non nella sezione sbagliata ma sono nuova e ho una domanda URGENTISSIMA, se qualcuno potesse rispondermi sarebbe una gran cosa 
con la western blot, contando che io liso il mio pellet(di una linea cellulare di leucemia) con RIPA, vedo l'espressione totale della proeina che sto cercando nella cellula?
ossia: se io sto cercando la TRASLOCAZIONE di una proteina(normalmente residente nel lume del RE) sulla membrana tra un controllo e un trattamento, e non una sintesi, non posso usare un protocollo classico di western, vero? e cambia qualcosa invece se nel protocollo aggiungo un passaggio di ultracentrifugazione, che in teoria mi separa le membrane?
grazie in anticipo!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 11:19:49
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La cosa migliore sarebbe separare le membrane dal citosol e poi fare il western su membrane e citosol sullo stesso gel.
Se guardi solo le membrane non puoi dire nulla, perchè un aumento potrebbe significare sia una maggior traslocazione della tua proteina sia una maggiore sintesi.
Dovrai invece guardare il rapporto proteina in membrana/proteina totale(=membrana+citosol). |
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pulce.wb
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 11:34:03
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grazie della risposta 
la sintesi l'ho esclusa tramite una PCR sul gene che sto cercando. come tecnica preferenziale io userei un FACS ma in questo caso non posso perchè tratto con antracicline, che emettono autofluorescenza quindi mi confondono il segnale, per questo vorrei un modo alternativo....
quindi, se ho ben capito, potrei separare citosol e membrane con ultracentrifuga, poi una western classica sui due lisati facendoli correre insieme e vedere se il segnale "passa" dalla banda citosolica a quella di membrana, giusto?
e, tanto per essere DAVVERO sicura, la western "classica" vede TUTTA la proteina? per dire, se io non trattassi con RIPA (o triton, o simili, buffer che in ogni caso mi lisano la membrana), non riuscirei cmq ad avere solo le proteine superficiali? non so se si intuisce ma mi sfugge un pò il passaggio dell'estrazione delle proteine dalla cellula.... 
(scusa se chiedo ancora conferma ma è davvero importante  ) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 12:56:09
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Citazione:
la sintesi l'ho esclusa tramite una PCR sul gene che sto cercando.
Ma non ti esclude ad es. una stabilizzazione dell'mRNA o un diminuito turnover della proteina.
Citazione:
quindi, se ho ben capito, potrei separare citosol e membrane con ultracentrifuga, poi una western classica sui due lisati facendoli correre insieme e vedere se il segnale "passa" dalla banda citosolica a quella di membrana, giusto?
Sì. Non ho mai separato le membrane, non so dirti quale sia il protocollo migliore però.
Citazione:
e, tanto per essere DAVVERO sicura, la western "classica" vede TUTTA la proteina? per dire, se io non trattassi con RIPA (o triton, o simili, buffer che in ogni caso mi lisano la membrana), non riuscirei cmq ad avere solo le proteine superficiali? non so se si intuisce ma mi sfugge un pò il passaggio dell'estrazione delle proteine dalla cellula....
No, in quel caso avresti le proteine totali, perchè quando lisi la membrana col Triton praticamente fai un mix di tutto, membrane e citosol.
Ad ogni modo a te interessa il rapporto fra controlli e trattati: se estrai le proteine con la stessa procedura nei due gruppi, anche se ci fosse qualche passaggio che ti fa perdere delle proteine non importerebbe perchè le perderesti allo stesso modo nei controlli e nei trattati. |
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pulce.wb
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 13:24:49
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| grazie ancora |
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