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miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2009 : 17:40:27

salve

non so se devo porre la domanda qua o in un altro forum
lavoro con culture cellulari e la mia proteina e' relised
devo fare un western blot e mi e' sorti un dobbio

ma oltre al lisato cellulare devo analizare anche il medium delle culture cellulari?
io credo di si

e come faccio?

io uso DMEM arricchito con FBS e HS e glutamina

grazie

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2009 : 18:08:51

Certo, se la tua proteina viene secreta allora sar� nel medium!!! Anzi potrebbe essere interessante vedere come diverse condizioni cambiano il rapporto proteina secreta/totale (o secreta/non secreta).

Ho un protocollo per preparare proteine per WB dal terreno, ma non ce l'ho qui con me, lo recupero e domani te lo scrivo. Comunque se non ricordo male si tratta semplicemente di precipitare le proteine e poi fare un normale WB.

PS: � released

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miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2009 : 10:52:38

ciao

si anche secondo me e' nel medium
ma non essendo pratica nella tecnica WB...
prima di avventurarmi preferisco chiedere e magari avere un protocollo

anche perche' neanche so se l'anticorpo funziona!!!

sono la prima a fare WB con questa proteina nel mio lab e da articoli letti... non si capisce nulla
ognuno usa condizioni differenti e pochi usano modelli in vitro e non specificano dove hanno preso la proteina (medium o?)

se puoi recuperare il protocollo
grrrrraaaaaazzzzziiiiiieeee miiiiiilllllleeeee

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2009 : 13:34:34

Non ho trovato il mio protocollo, comunque questo dovrebbe funzionare

* Prelevare il medium
* Aggiungere ugual volume di TCA (acido tricloroacetico) 20% ice-cold.
* Lasciare in ghiaccio 15'
* Centrifugare 10' a 10000g
* Rimuovere il surnatante e far asciugare il pellet all'aria
* Risospendere in Tris HCl 15 mM pH 7.8 (in un volume opportuno, parti da 1/50-1/100 del volume di medium iniziale)
* Procedi con un normale WB

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miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2009 : 13:52:43

gggrrrrraaaazzzziiiiieeeee

miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2009 : 13:56:53

ops

piccola domanda

procedi come normale WB
?

io di solito metto nella soluzione per estrarre le proteine dei inibitori
poi quantifico e faccio WB

in questo caso?
quantifico.... e faccio WB
o meglio mettere inibitori?

forse domanda stupida
ma ripeto.. non sono esperta in WB
grazie

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