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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
 Inserito il - 15 gennaio 2009 : 11:05:22
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ciao a tutti. avrei bisogno di consigli o idee. mi sta capitando una cosa molto strana. ho estratto RNA da tessuti di topo, li ho retrotrascritti ed ora sto mettendo su delle Real-Time. Uso il SyberGreen e faccio ogni punto in triplicato. il problema è che ho (per la maggior parte dei punti) dei triplicati orrendi. la cosa strana è che ho sempre una variabilità quasi fissa e crescente, ad esempio per un punto i Ct sono 23,3 - 24,5 - 26,8, e così per gli altri. questo succede sia per i miei geni sia per il normalizzatore (HPRT e GAPDH). é la prima volta che mi capita una cosa del genere. premetto che:
- per ogni coppia di primers faccio una mix comune;
- cambio SEMPRE puntale;
- ho provato a diluire di più il cDNA;
- ho provato a centrifugare il cDNA per eliminare eventuali aggregati.
a questo punto penso sia un problema di preparazione dell'RNA, o meglio di risospensione dell'RNA. ma il fatto è che questo mi succede per ben 6 campioni (3 tessuti ctr e 3 ko).
idee???
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 11:54:33
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Ciao Darkene, giusto per essere sicuro di capire che metodo usi: nel fare i triplicati metti prima la mix comune nei 3 pozzetti e poi aggiungi il DNA pozzetto per pozzetto o metti il DNA nella mix e poi aliquoti in triplo il tutto? Se non lo fai, ti consiglio il secondo metodo che da maggiori garanzie di riproducibilità.
Ti consiglio anche di lavorare con a fianco un vortex, io prima di aliqutare i replicati, prendo il tubo (con mix e DNA) e gli do una bella vortexata di 5 secondi (non alla massima potenza, ma sui 1200-1600 rpm) e poi do qualche spipettata e aliquoto subito. Ti consiglierei di dare prima una bella vortexata anche allo stock. Altri consigli che ti posso dare è se non l'hai già provato, di risospendere in TE invece che H2O. Poi (non so se è scaramanzia o altro) ho notato una riproducibilità più alta se prima preparo la mix, l'aliquoto, la metto al buio e al fresco fino a quando ho pronte le varie diluizioni di DNA da aggiungere. Fammi sapere!  |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 12:00:43
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faccio tutto quello che dici tu, ovvero metto il DNA nella mix, uso il vortex a bassa velocità,faccio riposare la mix per qualche minuto. non ho mai provato a risospendere in TE ma non credo sia una soluzione al mio problema. magari proverò.
altre proposte?
GFPinaaaaaa!!!!! |
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Manuxxx
Nuovo Arrivato
Città: Caserta
8 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 12:38:53
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O magari sospendere in TAE 1x...
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 13:14:58
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| Visto che ottieni una cosa così strana con vari templati diversi non direi che ci sono problemi di primers. Ma qualcuno utilizza i tuoi stessi reagenti, pipette e la tua macchiana da real-time? Così per escludere problematiche inerenti a eventuali starature o reagenti che sono andati a male. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 13:57:10
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
altre proposte?
GFPinaaaaaa!!!!!
Come concordavo appieno con marok in una discussione analoga (questa: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=10840), concordo anche ora!
Avrei detto le stesse cose. Magari leggiti anche quella discussione se non l'hai fatto.
Oltre alle cose già dette, uno dei problemi più plausibili è un problema di risospensione.
Altre cose possono essere problemi dello strumento, ad es. hai notato se c'è una ripetibilità nell'errore? Sono sempre gli stessi pozzetti che danno ct più elevati?
Una calibrazione dei pozzetti con un fluoroforo è stata fatta?
Altra prova: puoi cambiare l'ordine in cui semini i triplicati verticale/orizzontale e vedere se il risultato è lo stesso.
Altro al momento non mi viene in mente!
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 14:26:22
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allora:
- lo strumento e i reagenti sono apposto perchè di uso comune e gli altri non hanno problemi;
- l'errore non è pozzetto-specifico (ho provato a cambiare);
penso effettivamente sia un problema di risospensione.
io parto da 80-100 mg di tessuto (muscolo-cervello-fegato), frantumo in azoto, pottero e metto 1 ml di Trizol. alla fine risospendo l'RNA in 50 ul di H2O RNAsi free. forse dovrei aumentare il volume di risospensione!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2009 : 20:48:18
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Si però io pensavo di più a qualcosa nel cDNA!
Se fosse un problema di RNA comunque il cDNA che ottieni è quello ed è lo stesso per tutti i campioni, comunque non vedrei il motivo per cui dovresti avere variabilità.
Anche la retrotrascrizione è la stessa che fanno gli altri? I reagenti sono di uso comune? La metodica è la stessa?
Ho provato anche a cercare in rete qualcos'altro ma essenzialmente i consigli che danno tutti sono esattamente le stesse cose che abbiamo detto.
Ma tutto tutto è uguale a quello che utilizzano gli altri? Non c'è anche una minima cosa anche se ti sembra banale di diverso? (a parte il tuo GOI ovviamente!) |
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Discussione |
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brutti triplicati in real-time
Didattica
