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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
 Inserito il - 19 gennaio 2009 : 17:51:45
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ragà oggi ho avuto un problemino con la fase ECL, nel senso che dopo il rosso ponceau vedo bene le bande sul filtro poi lavaggi poi incubazione in latte-pbs-tween(0,1%) per 2 ore, 3 lavaggi con pbs-tween 0,3%, incubazione per 1 ora con Ab-II altri lavaggi però nulla, quando sviluppo la pellicola non ho visto un tubo.
Secondo voi potrebbe essere un problema di liquido di sviluppo e di fisaggio ?? ogni quanto andrebbero cambiati ?
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2009 : 18:18:47
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Dipende da quanto spesso vengono usati, se se ne fa un uso medio-alto ogni 3/4 mesi sarebbe forse buono cambiarli.
In particolare, se cominci a vedere molti depositi nei liquidi o se cominciano ad essere molto scuri vanno cambiati. |
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2009 : 18:23:29
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mhh beh se ne fa un uso medio ma cmq sono stati cambiati da novembre quindi...
Dopo averla immarsa nel liquido di sviluppo e poi di fissaggio la pellicola mi appare vuota, non vedo nulla, non riesco a capire qual'è il problema :-(
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2009 : 18:33:09
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Magari c'è stato un problema con questo particolare esperimento. Altre persone hanno avuto lo stesso tuo problema? Prima di fare cambiamenti io ripeterei l'esperimento, magari è stata semplicemente una cosa banale (chessò, ti sei scordato un anticorpo o hai messo per errore un secondario sbagliato etc)
Se poi nessun altro ha questo problema escluderei che si tratti dei liquidi di sviluppo, anche perchè di solito quando sono vecchi ti fanno venire le lastre scure non bianche. |
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2009 : 18:48:31
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no, purtroppo è una fase in cui sono l'unico a fare western dove lavoro. E' dalla settimana scorsa che sto avendo dei problemi con lo sviluppo della lastra. Fino al trasferimento tutto bene, poi ripeto le stesse procedure che faccio da sempre ma ho avuto lo stesso problema sia quando ho usato un anticorpo secondario anti-mouse sia l'anti-rabbit e anche oggi che ho utilizzato un kit a parte volendo vedere l'espressione della chinasi ERK, sia per la forma basale che fosforilata non ho ottenuto nulla, mentre prima di natale ebbi tutt'altro risultato.
Nn so se è qualkosa che sbaglio io e non riesco davvero a capire cosa seppur sto ripensando a tutte le tappe eseguite in questa fase, oppure c'è qualkosa che non va magari in qualke reagente.
La settimana scorsa ad esempio feci alfaV incubandolo con un secondario anti-rabbit e nn ottenni risultato, lo stesso filtro sottoposto a lavaggi e poi di nuovo a incubazione con primario e poi secondario anti-mouse invece mi diede un risultato.
Sconforto totale.
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 01:02:02
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Vedere se i liquidi funzionano è semplice!
Prendi semplicemente un pezzettino di lastra e la "sviluppi"
Il liquido di sviluppo da alla lastra una colorazione "grigina" (dipende dal tipo di lastra), se la lastra rimane gialla il liquido non funziona più.
Il fissativo rende la lastra chiara, se la lastra rimane opaca allora non va più bene!
Il tuo problema sembra altro, al massimo può essere l'ECL che non funziona.
Non hai dei controlli positivi da testare, tipo anticorpi che vengono sicuramente?
Io utilizzo in genere anche uno standard che si vede sulla lastra, se non si vede neanche quello allora c'è qualcosa che non va nel metodo di rivelazione (ECL).
La storia dell'anticorpo secondario muose/rabbit non l'ho ancora capito! Se era un anticorpo fatto in mouse è normalissimo che con il secondario di rabbit non abbia funzionato! |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 08:46:32
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| per avere la conferma che hai il liquido di sviluppo fallato prendi una pezzo di lastra e mettila fuori dalla finestra in una bella giornatta di sole. Poi sviluppalo. Se rimane chiaro è il liquido di sviluppo |
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 10:29:23
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mhh, io piuu che altro stavo pensando alla soluzione di svilluppo 1 e 2, quelle usate in rapporto 1:1 :-(
vi terro aggiornati
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 17:06:06
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Citazione:
Messaggio inserito da Biotecgen
mhh, io piuu che altro stavo pensando alla soluzione di svilluppo 1 e 2, quelle usate in rapporto 1:1 :-(
vi terro aggiornati
Si infatti è quello che dicevo io! Prova con un anticorpo contro una proteina sicuramente molto esperessa, actina, tubulina... qualcosa che usi come controllo.
Se non ti viene neanche con quello può darsi che sia l'ECL. |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 19:48:36
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| noi quando usavamo le lastre ogni tanto avevamo il tuo stesso problema..l'ecl ogni tanto dava un bel segnale,ogni tanto non lo dava..ogni tanto calava dopo pochi secondi..secondo me il problema è quello perchè se usi sempre lo stesso protocollo e ripeti sempre le stesse operazioni... |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Fase ECL
Didattica e Relazioni
