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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2006 : 23:49:29
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Ci sono piccole cose sui miei appunti che non riesco a chiarire:
- facendo un esempio sulle differenze con la classica PCR e con la sua analisi end-point, si dice che partendo da due campioni con numero di copie di DNA diversi, alla fine della amplificazione si possono ottenere stesse quantità e solo nella fase esponenziale della curva di PCR, la differenza del numero di copie è costante! E fin qua è tutto corretto!
Ma poi mi fa l'esempio opposto: partendo da un certo numero di campioni con la stessa quantità di DNA iniziale, dopo l'amplificazione posso ottenere diversi valori finali di amplificato e le curve della reazione di PCR, si sovrapporranno solo nella fase esponenziale. Ma come è possibile che partendo dallo stesso DNA, nello stesso termociclatore, alla fine ottengo valori diversi?
- parlando di come costruire la curva standard, si parla dell'utilizzo di DNA virale e batterico.
Poi però, si introducono nel discorso dei plasmidi con un inserto.
Purtroppo, nè gli appunti, nè le slides sono chiare! In sintesi, quello che c'è scritto è questo:
"per il DNA, si calcola la concentrazione mediante spettrofotometro e poi con una formula, in base a dimensioni di plasmide e inserto, si converte la concentrazione in numero di copie.
Per l'RNA, il plasmide viene trascritto e poi come prima: valuto la concentrazione e converto in numero di copie!"
Non capisco come e (soprattutto) se questo discorso si collega alla costruzione della curva standard!
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2006 : 03:58:29
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Allora, per la prima parte devi considerare che amplificando 2 volte lo stesso campione con la stessa Taq, la stessa macchina etc etc potresti non avere lo stesso risultato perche' ci sono molte variabili che ti influenzano il tutto. Ad esempio in media metti 1/2 ul di campione, quindi e' facile che ci sia un po' di differenza su volumi cosi piccoli, specie se lo fai a mano. Stesso dicasi per la quantita' di Taq che solitamente e' meno di 1 ul.
Poi ci possono essere altre cose, tipo che una goccia di campione che ti rimane sul bordo della provetta, qualcuno che passa correndo vicino al termociclatore e fa muovere il tutto.... insomma usa la fantasia!!! 
Comunque se ti puo consolare, facendo una real time sullo stesso campione in triplo di solito non hai curve totalmente sovrapposte!
Per quanto riguarda la curva standard, io l'ho sempre vista fare con quantita' note di DNA viste come ng/ul. Pero' suppongo che se usi un plasmide puoi fare una curva std con ad es. 20, 50, 100, 200 e 500 copie e cosi determinare quante copie avevi nel tuo campione (che ovviamente doveva contenere lo stesso plasmide). |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2006 : 13:30:29
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Grazie per la risposta!
Per la seconda parte, le concentrazioni vengono infatti espresse in ng/ul, ma poi ci hanno detto che vengono convertite in numero di copie.
Quindi, utilizzando il plasmide, io comunque valuto la sua concentrazione o quella dell'inserto? Perchè poi non capirei la necessità di trascriverlo volendo usare RNA dell'inserto! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2006 : 20:45:41
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In alcune situazioni potresti voler sapere quante copie del tuo plasmide hai in un certo campione, quindi usi una retta di taratura
"a numero di copie". Ovviamente se hai solo plasmidi il numero di copie del plasmide e' uguale a quello dell'inserto.
Per l'RNA proprio non so... io usavo uno standard interno e mi riferivo a quello, senza fare rette di taratura! :) |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2006 : 21:58:32
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| Ok, ho capito! Grazie ancora! |
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