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Autore Discussione  

episoma
Nuovo Arrivato


Prov.: Mantova
Città: Gonzaga


2 Messaggi
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 21:10:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di episoma Invia a episoma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Gentilissimi colleghi, ho una questiona da sottoporvi. Sto eseguendo (o meglio cerco di eseguire) delle RACE PCR. Partendo da contig presenti su ESTree database sto cercando di ottenere le sequenze complete di alcuni geni candidati in pesco. Ho disegnato i primer utilizzando primer3, controllati e ricontrollati anche blastandoli in NCBI per evitare il loro annelling con altre regioni. L’amara scoperta è che su gel si evidenzia un amplificato (comunque molto specifico) solamente nelle RACE 3’ mentre nelle 5’ noto la classica nube di desossi a fine corsa. Ho immediatamente rifatto il First Strand partendo sia da mRNA che da RNA totale (lavoro su RNA estratto dal polpa) pensando che il problema fosse una degradazione a carico del F.S.5’. Ho riprovando come da “copione” ma niente. Anche primer precedentemente utilizzati, che davano buoni risultati ai miei “predecessori” ora non funzionano in RACE 5’. Tutto è molto strano. Uso il kit della clontech per fare la RACE e quello dell’invitrogen per ottenere i First Strand (come facevano prima di me). CONSIGLI?
Andrea A.

episoma
Nuovo Arrivato


Prov.: Mantova
Città: Gonzaga


2 Messaggi
Inserito il - 25 febbraio 2009 : 00:59:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di episoma Invia a episoma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Solo per informarvi, adesso sto ho fatto il F.S. utilizzando Smart II poliA e eptameri partendo da mRNA. magari riesco ad ottenere un cDNA utile! domani verso sera lo sapro. Il prossimo tentativo sara quello di fare un decapping dell'mRNA mediante fosfatasi alcalina e pirofosfatasi acida. scusate, cosa non era chiaro nel mio quesito? me lo chiedo (e ve lo chiedo) perchè nessuno ha saputo darmi una mano! Ora spero che una delle soluzioni che ho trovato possano aiutarmi!

CIAO!
Andrea A.
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