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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2009 : 18:34:32
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ciao...
sto preparando l'esame di ingegneria genetica e mi domandavo se
qualcuno potesse illuminarmi sulle differenze di applicazioni tra geni reporter autonomi (con il loro promotore) e geni reporter di fusione. Inoltre sono in crisi con il metodo F.R.E.T di PCR quantitativa 
grazie...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 19:19:30
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Un gene reporter col suo promotore verrà espresso dove viene espresso quel promotore.
Questo ti può servire per:
- marcare selettivamente alcuni tipi di cellule. Es. usi un promotore espresso solo dal tipo cellulare X per avere solo le cellule di tipo X marcate (questo si fa generalmente generando animali transgenici).
- studiare un certo fattore di trascrizione che lega quel certo promotore. In questo caso il reporter serve solo come indice che il reporter è stato attivato.
Un gene reporter di fusione, invece, ti serve per vedere dove è localizzata la proteina con il quale lo fondi. Lo puoi usare ad es. per investigare la localizzazione subcellulare di una proteina (anche se questo metodo ha un caveat importante, cioè che stai presupponendo che la proteina di fusione si comporti come quella normale).
Per la FRET in real time cosa non ti torna?
Forse questo ti può aiutare
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=883 |
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 00:18:02
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grazie
per i geni reporter 6 stato chiarissimo (come sempre del resto)
per quanto riguarda la FRET...ho guardato il link e ho letto la spiegazione della Taqman (1 unica sonda con quencher e fluoroforo alle estremità), ma la FRET...so qualche accenno sul fatto che si usano 2 sonde , 1 col quencher e 1 col fluoroforo. Ti risulta? E inoltre: il meccanismo è sempre lo stesso (Taq pol che avanzando con attività esonucleolitica 5'-->3' smangia le sonde annullando l'effetto smorzante del quencher)?
thnx |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 09:04:05
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Taqman è solo il nome commerciale di un metodo, che sfrutta un fenomeno di FRET (fluorescence resonance energy transfer) che è un fenomeno fisico.
Semplificando, tu hai un fluoroforo (che può essere legato a quello che vuoi tu es. una proteina o del DNA, ma anche essere libero) che assorbe alla lunghezza d'onda x ed emette alla lunghezza d'onda y. Se nelle vicinanze (MOLTO vicino) hai un secondo fluoroforo che assorbe ad y ed emette a z, puoi eccitare questo secondo fluoroforo con l'emissione del primo (che a questo punto non vedrai più) e vedrai invece la fluorescenza del secondo.
Insomma, qualcosa tipo:
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 11:36:30
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grazie!!!!!
6 sempre d 1 lucidità sconvolgente...a presto
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geni reporter
Didattica
