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jeje
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52 Messaggi
Inserito il - 26 febbraio 2009 : 12:02:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti...ho un ennesimo problema..
ho lisato con il buffer..poi ho quantificato le proteine e le ho fatte correre su un gel al 7.5 %...infine ho fatto il trasferimento..
con il pounceau nn vedo niente e nn vedo piu niente nelmeno nel gel!!
premesso che ho usato un marcatore che è corso bene nel gel e che si è trasferito bene.
cosa è successo?

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato



116 Messaggi
Inserito il - 27 febbraio 2009 : 11:31:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mattia.dinunzio Invia a mattia.dinunzio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se ho ben capito il marker si è trasferito ma le tue proteine sono sparite e che non le vedi ne nella nitro e manco nel gel giusto? forse non hai schiacciato bene il "panino" e si sono perse nel blotting buffer
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi
Inserito il - 27 febbraio 2009 : 16:23:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie...
ho provato inoltre a caricare su gel il mio campione..e la concentrazione nn è quella reale...io uso il metodo DCdella bio rad puo essere che contaminazione con il genomico mi abbia sballato e sovrastimato la mia concentarzione proteica finale?
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi
Inserito il - 27 febbraio 2009 : 16:25:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie cmq!!!
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi
Inserito il - 04 marzo 2009 : 12:05:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
domanda quanto posso caricare nel minigel per pozzetto? 20 microlitri?
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato



116 Messaggi
Inserito il - 04 marzo 2009 : 16:02:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mattia.dinunzio Invia a mattia.dinunzio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
intendi da 0.75? secondo riesci a caricare abbastanza tranquillamente 20uL
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 04 marzo 2009 : 17:11:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti dipende dallo spessore del gel e dal numero dei pozzetti, quindi in sostanza dalla grandezza del pozzetto!

Dovresti essere piu preciso, che minigel stai usando? E che spessore e tipo di pettinini.
Questa è una tabella per i minigel Bio-Rad:
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi
Inserito il - 01 aprile 2009 : 11:01:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie, altra domanda posso caricare nel mini gel biorad con 10 pettini e spessore di 0.75 100 microg di lisato?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 01 aprile 2009 : 11:20:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da jeje

grazie, altra domanda posso caricare nel mini gel biorad con 10 pettini e spessore di 0.75 100 microg di lisato?

Beh dipende dal volume!!!
Comunque più che una questione di quanto puoi caricare nel pozzetto è più quanto migrerà nel gel. 100 microgrammi mi sembrano tanti!
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi
Inserito il - 04 aprile 2009 : 08:50:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, perchè non provi a fare una nuova corsa e a colorare il gel con il COOMASSIE COLLOIDALE che è molto più sensibile del rosso ponceau (si possono vedere proteine fino ad una concentrazione di nanogrammi)...almeno controlli che fine fanno le tue proteine. Chiaramente se ti serve il western blot devi fare una corsa parallela a questa con gli stessi volumi e le stesse concentrazioni di proteine per paragonarle tra loro.
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