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Autore

Discussione

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato

116 Messaggi

Inserito il - 03 marzo 2009 : 15:08:42

Ciao ragazzi, vi chiedo un parere dall'alto dlla vostra infinita esperienza. nel valutare l'espressione genica secondo voi � affidabile la one-step PCR, cio� la PCR in cui metti all'interno di un unico tubo di saggio dal campione di RNA ai primers, dalla retrotrascrittasi alla polimerasi con sybr green? Posso immaginare che il metodo classico con retrotrascrizione, corsa su gel di agarosio e poi amplificazione in real time tutti separati sia il migliore ma volevo sapere se la one-step pu� risultare essere comunque affidabile.
grazie infinite
ciaooooo

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2009 : 03:01:25

Io preferisco fare gli steps separati, (dopo retrotrascrizione pero' non faccio migrare su gel di agarosio! Tu si?), comunque dovrebbe essere affidabile in ogni caso.
Il fatto principale secondo me � questo:
se fai una two-step hai una provetta con il tuo cDNA e questo lo suddividi per il tuo GOI e per l'HK (io comunque normalizzo sempre con 3 HK), se fai una one-step hai una provetta con il cDNA che userai per il tuo GOI e una (o pi�) che userai per l'HK quindi non � esattamente lo stesso cDNA.
In sostanza introduci delle variabili in pi�, la quantit� di RNA che metti potrebbe non essere la stessa nelle varie provette, l'efficienza della retrotrascrizione potrebbe essere leggermente diversa nelle varie provette...
Tuttavia non credo che l'errore sia cos� grande da rendere "inaffidabili" i risultati!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2009 : 20:26:24

Cercando un'altra cosa, ho trovato questo: RT-PCR in real-time applications: one-step or two-step QRT-PCR Minireview (pdf)

Magari ti pu� interessare.

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato

116 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2009 : 08:43:55

Grazie mille e a buon rendere