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gutemall
Nuovo Arrivato

Prov.: FERRARA
Citt�: FERRARA

4 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2009 : 16:53:33

Ciao ragazzi!!!!
UUUH, prima domanda per voi, visto che mi sono appena iscritta!!!!
Devo fare una FISH su dei topini trangenici, ma non posso far una biopsia, quindi volevo preparare il campione da sangue periferico.
Qualcuno mi pu� dare idee per il campionamento visto che non ne ho idea di come vada poi trattato il sangue per bloccare le cellule in metafase

GRAAAAAAAAAAAAZIE!!!!!

Simona84
Utente Junior

Citt�: milano

131 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2009 : 21:24:48

auguri...dai topini � difficilissimo tirare fuori delle metafasi perch� i protocolli non sono standardizzati e il sangue � davvero troppo poco...se non riesci, se ne hai la possibilit� potresti farlo con le milze o dai fibroblasti cutanei!avresti maggiore possibilit�. cmq per ottenere metafasi da linfociti (sangue periferico) il principio generale � quello di stimolare la crescita con fitoemoagglutinina (PHA) e mettere il "sangue" in coltura in provette a becco di clarino in condizioni standard (37�C, 5% CO2, etc). poi quando hanno raggiunto la fase esponenziale di crescita (dovresti prima farti una curva di crscita), per sangu umano la coltura va dai 2 ai 3 giorni. poi viene aggiunta colchicina (2 goccie con la pasteur di vetro) e si lascia ancora in incubatore per 1h.
al termine si procede con un protocollo che prevede un trattamento ipotonico e poi il fissaggio dei cromosomi in metanolo:acido acetico 3:1. il preparato viene poi stisciato sul vetrino e puoi guardare a microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 20X (non serve il coprioggetto per vedere se hai ottenuto delle metafasi... al massimo potresti provare a fare una FISH interfasica se proprio non puoi fare una biopsia e se non ottieni le metafasi, dipende cosa devi vedere e che tipo di sonda utilizzi (immagino che dovrai valutare i siti inserzionali del transgene no?). altro consiglio hai provato a vedere su pubmed??
in bocca al lupo!!!

Simona84
Utente Junior

Citt�: milano

131 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2009 : 21:26:52

ah dimenticavo anche il tempo con la colchicina � variabile...devi mettere a punto i tempi...si va dai 15 minuti delle linfoblastoidi fino a o/n...dipende dal campione da cui si parte...e dalla velocit� di duplicazione delle cellule..� tutto prove ed errori!!

gutemall
Nuovo Arrivato

Prov.: FERRARA
Citt�: FERRARA

4 Messaggi

Inserito il - 05 marzo 2009 : 11:49:44

Su pubmed avevo gi� guardato ma non ho trovato un protocollo per bene!!!
purtroppo non riesco fare delle biopsie perci� dovr� fare un prelievo retro-oculare! Purtroppo...
Cmq grazie delle info!!!
incrocio le dita!!!

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 05 marzo 2009 : 12:54:39

Citazione:
perci� dovr� fare un prelievo retro-oculare

ouch... non ti invidio

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