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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 10 marzo 2009 : 18:07:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti!
sto preparando l'esame di biologia molecolare e tra le varie esperienze di laboratorio che sto studiando c'è un'amplificazione di una regione di un promotore, in cui è presente un polimorfismo, che dovrò poi analizzare.
Il primo passo è una PCR per amplificare la sequenza polimorfica. Dopo di che ci sono due corse elettoforetiche, una su agar al 2% e l'altra su poliacrilammide al 12%.
A cosa mi sservono??

grazie mille....sono disperata...

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 10 marzo 2009 : 22:44:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Potresti spiegare meglio? Detto così è difficile da capire!
E' una esperienza che avete fatto in laboratorio? Se si non ti ricordi cosa avete fatto esattamente? Hai delle immagini?
Dopo la PCR sei sicura che l'amplificato è stato seminato direttamente su gel, non è stata fatta ad esempio una reazione di restrizione?
Su gel che bande vedi? Quante e di che PM?
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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 09:58:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
hai ragione è poco chiaro...ma abbiamo fatto questa esperienza molto tempo fa...e mi è rimasto solo il protocollo di base...non ho i risultati.
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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 10:21:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina


Potresti spiegare meglio? Detto così è difficile da capire!
E' una esperienza che avete fatto in laboratorio? Se si non ti ricordi cosa avete fatto esattamente? Hai delle immagini?
Dopo la PCR sei sicura che l'amplificato è stato seminato direttamente su gel, non è stata fatta ad esempio una reazione di restrizione?Su gel che bande vedi? Quante e di che PM?


no nessuna restrizione...abbiamo caricato l'amplificato + blu di bromofenolo e un marker di perso molecolare nell'elettroforesi su agar. mentre in quella su PAA come marker un campione a genotipo noto e le lastrine del gel precedente...
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 10:53:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

provo a supporre

il gel 2% agar puo' servire a vedere se la vostra PCR e' venuta
e' al 2% perche' il vostro frammento e' piccolo

poi avete fatto il gel 12%poliacrilammide per separare il polimerfismo

mi spiego...

si possono separare frammenti PCR di diverse dimensioni usando il gel poliacrilammide
e' una gel piu sensibile del agar

certo non e' un polimorfismo di una solo base!!!!

leggi questa pagina
http://www.minerva.unito.it/Chimica&industria/Tesi1/ElettroforesiAcidiNucleici.htm

ora vedi se quello che ti ho detto potrebbe avere un senso con quello che avete fatto in laboratorio
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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 11:14:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da miky76

ciao

provo a supporre

il gel 2% agar puo' servire a vedere se la vostra PCR e' venuta
e' al 2% perche' il vostro frammento e' piccolo

poi avete fatto il gel 12%poliacrilammide per separare il polimerfismo

mi spiego...

si possono separare frammenti PCR di diverse dimensioni usando il gel poliacrilammide
e' una gel piu sensibile del agar

certo non e' un polimorfismo di una solo base!!!!

leggi questa pagina
http://www.minerva.unito.it/Chimica&industria/Tesi1/ElettroforesiAcidiNucleici.htm

ora vedi se quello che ti ho detto potrebbe avere un senso con quello che avete fatto in laboratorio



ti ringrazie davveo...credo che sia proprio così...cioè la prima è una separazione in base al pm dei frammenti amplificati e la seconda è una genotipizzazione dei polimorfismi...
grazie davvero a tutti!
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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 11:30:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ehm...un'altra domanda...nella colorazione del gel con silver staining immergo il gel prima in Aclool etilico al 1o% per 5' e poi in Acido nitrico all'1% per 3'. Perchè?
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 14:32:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

ragazzi che domande da corso di chimica!


l'alcol etilico e'per fissare il DNA su gel
di questo ci metto la mano sul fuoco

acido nitrico invece non mi ricordo a cosa serva...
ma suppongo serva solo a preparare il tutto per la reazione successiva con il nitrato di argento

spiacente ma non posso esserti molto di aiuto
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 14:37:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si infatti evidentemente si tratta di un polimorfismo di alcune paia di basi (alcune basi in più o in meno) non di una singola base.
L'altra possibilità sarebbe quella di discriminare il polimorfismo mediante PCR, ma avreste dovuto fare 2 PCR diverse e non mi sembra questo il caso.

Citazione:
Messaggio inserito da masisa

ehm...un'altra domanda...nella colorazione del gel con silver staining immergo il gel prima in Aclool etilico al 1o% per 5' e poi in Acido nitrico all'1% per 3'. Perchè?

L'etanolo serve per fissare il DNA sul gel, mentre l'acido nitrico serve per portare il gel ad un pH acido. Dopo aver messo il gel a contatto con una soluzione di nitrato di argento si aggiunge sodio carbonato e formaldeide, il pH diventa improvvisamente basico e sali di argento vengono ridotti ad argento metallico che precipita, in questo modo il DNA risulta colorato.
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masisa
Nuovo Arrivato



8 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2009 : 16:17:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masisa Invia a masisa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie grazie grazie!!!!!
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