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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
 Inserito il - 16 marzo 2009 : 14:43:06
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Mi è successa una cosa veramente strana con una ligation..forse qualcuno di voi può darmi qualke suggerimento su cosa possa essere accaduto. La piastra della ligation positiva ( con l'inserto ) ha una sola colonia, quella della ligation negativa ( senza l'inserto) ha una marea di piccole colonie difficili da contare. Se il vettore si è ricicorlarizzato da solo significa che la digestione fatta con due enzimi differenti non ha avuto buon esito. Ipotizzerei che un enzima è stato molto meno efficiente dell'altro. Ma perchè la ligation con l'inserto ha una sola colonia? Perchè in quel caso il vettore non ssi è ricircolarizzato? Escludendo che le piastre siano state fatte cosi male da contenere troppo antibiotico in una e niente nell'altra ( le ho fatte io ed escludo di essere stata così maldestra ) quale ipotesi fareste voi?
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 19:45:57
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| Secondo me hai avuto una bassa efficenza di ligazione dovuta a motivi di tecnica utilizzata poichè se hai utilizzato due enzimi differenti che vanno a tagliare su di un polylinker la digestione dovrebbe essere efficente. A quale temperatura è avvenuta la ligazione e quali concentrazioni di protocollo hai utilizzato? |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 11:58:06
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| la temperatura di ligation è stata di 16 gradi per tutta la notte. Le concentrazioni non te lo so dire, in realtà non l'ho fatta io.Ma oggi che sia stato veramente un problema di piastre perchè ripetendo l'elettroporazione con la stessa ligation ho avuto due piastre senza colonie. sicuramente la ligation non è andata bene ma quella differenza enorme tra controllo positivo e negativo proprio non me la spiegavo. |
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saretta3
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 12:51:23
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| Sono anch'i0 alle prese con un clonaggio, è il primo, ma non sapevo che si potessero elettroporare i batteri.. Cmq anch'io la prima volta ho fatto una ligation con T4 16°C O.N., ho ottenuto un sacco di colonie, efficienze pari alla tr4asformazione di controlo con vettore scarico, una pcr positiva per la presenza del frammento, ho fatto degli stock delle colonie screnate, ma quando ho inviato il costrutto a sequenziare il frammento era sparito. ora ho ricominciato daccapo con più enziama in fase di ligation, ma stessi tempi e temperatura. Può essere che il vettore ha perso l'inserto o un problema di ligation? Ciao |
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