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daruma
Nuovo Arrivato
Città: Stuttgart
12 Messaggi |
 Inserito il - 27 marzo 2009 : 13:27:09
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salve a tutti,
una domanda: ho del cDNA su cui devo disegnare 2 primers per un esperimento di real-time. il problema e' che per il gene che mi interessa non esiste nulla sulle gene-banks. ho gia' trovato un housekeeping gene che funziona perfettamente, cio' significa che la sintesi del cDNA ha funzionato. gia' un primo passo... ora ho trovato, per il mio gene di interesse, un tratto di sequenza, ma di mRNA. la mia domanda e': come posso disegnare dei primers su una sequenza di mRNA perche' funzionino con il mio cDNA? che variazioni devo apportare?
grazie mille e saluti,
DARIO
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 14:48:06
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scusa non capisco la domanda
tu sei andato su pubmed ed hai ora la sequenza mRNA?
se si...
la metti in un programma che disegna primer
se non ne hai uno
www.cgi" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
e disegni i tui primers possibilmente in esoni diversi e compatibili con la Ta della real time
e di solito funziona
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daruma
Nuovo Arrivato
Città: Stuttgart
12 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 16:22:23
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| scusa ma non capisco la risposta! :)) si, ho trovato un frammento di mRNA su NCBI. ma io ho cDNA, non mRNA. quindi se disegno i primers sulla sequenza di mRNA, devo considerare che devo "adattarli" al cDNA che e' il suo complementare... e come faccio a capire quali sono gli esoni da una sequenza e distinguerli dagli introni?? grazie mille per l'aiuto! ;) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 18:12:53
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Citazione:
quindi se disegno i primers sulla sequenza di mRNA, devo considerare che devo "adattarli" al cDNA che e' il suo complementare
No, l'mRNA è a singolo filamento, il cDNA è a doppio filamento, quindi ha un filamento complementare ed uno identico (a parte le U che diventano T)
Comunque qualsiasi software tu usi per generare i primer tiene conto di questa cosa, quindi a meno che tu non voglia disegnare i primers a mano... non è un problema
Citazione:
Come faccio a capire quali sono gli esoni da una sequenza e distinguerli dagli introni
Se hai del cDNA non hai introni.
Comunque quando trovi una sequenza di RNA su NCBI ti dice quali sono gli esoni in basso nelle features, trovi qualcosa tipo:
exon 1..100
exon 101..250
exon 251..300
Questo vorrebbe dire che hai 3 esoni, dal nucleotide 1 al 100, dal 101 al 250, e dal 251 al 300.
Essendo mRNA (o cDNA) NON ci sono introni, quindi gli esoni sono attaccati.
E' importante però sapere quali sono gli introni perchè se stai facendo una PCR (qualitativa) vorrai costruire i tuoi primers a cavallo tra due esoni (es. nel mio esempio potresti fare un primer che va da 90 a 110) in modo da non amplificare del DNA genomico.
Qui trovi un esempio di come creare i primers con Primer3
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1655
In NCBI puoi anche cliccare su "Pick primers" in alto a dx e ti porta al loro primer designer (Primer-BLAST) che è molto carino.
In alternativa come suggerito da domi volendo si può anche usare CLC Sequence Viewer
http://www.molecularlab.it/insidebioinfo/?p=78
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