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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:08:30
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Allora ragazzi ho dei probelemi con le soluzioni e diluizioni. se devo preparar un terreno di coltura per E.Coli e uso un Luria Bertani preprato cosi :
bactotriptone 10g/L
estrsto di lievito 5 g/L
NaCl 10 g /l
mettiamo caso che io voglia preparare un brodo di coltura in un backer da 250 ml .
allora è come se io dovessi fare la proporsione :
10g : 1000mL = xg : 250mL
xg = (250 X 10 ) / 1000 = 2,5 g
per cui io dovrò aggiungere 2,5 g di bactotriptone ; 2,5 g diNaCl ; e 1,25 g di estratto di lievito .
Dopo dovrò portare a volume fino a 250 mL .
Per preparare poi il terreno agarizzato per le piastre Petri aggiungo a terreno liquido ( brodo ) , 15 g / l di agar , per cui sempre con il ragionamento di prima 3,75 g in 250 mL . Poi ci metto gli antibiotici ( cloromfenicolo o katamicina non so le concentrazioni ) e lo sterilizo in autoclave a 120°C , 1 Atm , 20 min .
RAGA é GIUSTO QUELLO CHE HO SCRITTO SECONDO VOI ??
Scusate ma stò preparando una tesi e sapete bene che teoria e pratica sono cose un pò diverse ...mi affido al vostro aiuto ...grazie ragà !!!
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:31:38
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Citazione:
10g : 1000mL = xg : 250mL
xg = (250 X 10 ) / 1000 = 2,5 g
per cui io dovrò aggiungere 2,5 g di bactotriptone ; 2,5 g diNaCl ; e 1,25 g di estratto di lievito .
Dopo dovrò portare a volume fino a 250 mL .
Per preparare poi il terreno agarizzato per le piastre Petri aggiungo a terreno liquido ( brodo ) , 15 g / l di agar , per cui sempre con il ragionamento di prima 3,75 g in 250 mL . Poi ci metto gli antibiotici ( cloromfenicolo o katamicina non so le concentrazioni ) e lo sterilizo in autoclave a 120°C , 1 Atm , 20 min .
Esatto. Puoi vederla anche così: se devi mettere 10g in un litro, in 1/4 di litro dovrai metterne 1/4 di 10, cioè 2.5
Per le [] di antibiotici guarda qui: http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=7
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2009 : 17:06:46
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No aspetta!
Oltre a quello detto da chick80, qua c'è un errore:
Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
Poi ci metto gli antibiotici ( cloromfenicolo o katamicina non so le concentrazioni ) e lo sterilizo in autoclave a 120°C , 1 Atm , 20 min .
Prima sterilizzi il terreno in autoclave, poi, quando il terreno si è raffreddato (sotto i 60°C almeno) ci aggiungi l'antibiotico! Altrimenti l'antibiotico si "scassa" e non serve a niente!
Puoi anche preparare piastre petri senza antibiotico e poi aggiungere l'antibiotico nella petri quando ti serve, si usano delle spatole per spargere la soluzione di antibiotico sulla superficie della petri. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:09:21
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| In effetti ragionandoci un pò su ...quello degli antibiotici era una cavolata ...cmq grazie mille per avermi fatto notare i protocolli per l'uso di antibiotici , mi sono davvero molto utili graze ancora |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:32:48
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pure di meno dei 60°C dipende che antibiotico,non mi fiderei molto dell'aggiunta dell antibiotico messo dopo
ma e' una mia opinione |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:43:01
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una cosa mi sono dimenticato riguardo alla SDS-PAGE . Ho letto che in genere qst tecnica viene usata formando delle " discontinuità " .. bene .. Per fare questo uso un Tris glicina a pH 8,3 nel tampone , un Tris HCl a pH 6,3 nello stacking gel e uno Tris HCl a pH 8,8 nel nel running gel . Una volta caricato le cuvette nello stacking gel con le proteine da separare ( nel quale avevo messo anche SDS e il beta-mercaptoetanolo in modo da renderle lineari e cariche negativamente ) applico la d.d.p a 200 V per un'oretta ( almeno credo ) . Quello che succede in sintesi è che il glicerono nel tampone essendo a pH 8,3 e ricordandomi la benedetta formula di H-H ( glicina pKa1 = 2,3 e pKa2 = 9,8 ) so che il gruppo carbossilico è COO- e il gruppo amminico è NH3+ , quindi nella maggior parte in forma zwitterione ( neutra ) , ma il libro mi dice che un 5 % è carica negativamente ...bene ... allora sarà lei a trasportare la corrente ... Appena arriva all'apice dello stacking gel pH 6,3 in Tris HCl , per cui è dinuovo zwitterione ( neutro ) , ma la percentuale delle molecole negative sarà molto piu bassa ( almeno credo ) per cui saranno le proteine stesse a portare la corrente , in qst caso il gel è a maglie strette per cui V = I R , IL VOLTAGGIO DOVREBBE ESSERE BASSO A CAUSA DELLA RIDOTTA I E RIDOTTA RESISTENZA , in qst caso la velocità di migrazione è BASSA .
Poi nel running gel invece la R è alta e il VOLTAGGIO CRESCE per cui la velocità di migrazione è alta ...Ok ?
Quello che nn capisco è il ruolo dello ione CL- nell HCL a pH 6,3 per cui totalmente dissociato.... Mi aiutate per favore . Grazie mille |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:48:10
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
pure di meno dei 60°C dipende che antibiotico
Beh si il punto è che se si parla di terreno con Agar non deve essere troppo caldo, ma neanche iniziare a solidificarsi!
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
non mi fiderei molto dell'aggiunta dell antibiotico messo dopo
ma e' una mia opinione
Guarda a me in Germania facevano fare così e riusciva tutto alla perfezione! Jawohl!!!
Poi era divertentissimo!  C'era una specie di minipiatto rotante dove mettevi la piastra, la facevi girare e con una spatolina fatta apposta a T spargevi l'antibiotico!
Sopratutto è comodo se devi fare clonaggi con vettori con resistenza a diversi antibiotici, hai tutte le tue petri belle pronte e a secondo del tuo vettore ti prepari le piastre necessarie con l'antibiotico adatto. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:53:06
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Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
Quello che nn capisco è il ruolo dello ione CL- nell HCL a pH 6,3 per cui totalmente dissociato.... Mi aiutate per favore . Grazie mille
Detto in 2 parole: il Cl- (mi raccomando scrivi Cl e non CL!!!) è quello che migra più velocemente nello stacking gel, la glicina sta in fondo e le proteine nel mezzo e vengono schiacciate.
Però per non stare a rifare tutta la spiegazione ti rimando a queste 2 discussioni e link allegati:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5581
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=6746
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Lucy
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
3 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2009 : 22:57:39
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| giusto |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2009 : 15:20:02
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| Ok ci sono . Inoltre molto spesso si parla di tamponi di estrazione i piu comuni sono tris e fosfato , vi chiedo perche sono ingrado di estratte le proteine ? |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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