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romyna
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 03 aprile 2009 : 12:08:13
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Salve a tutti e' la prima volta che uso questo forum , quindi scusatemi se sbaglio qualcosa.
Estraggo Rna e Dna da biopsie cardiache su cui cerco genomi virali responsabili di miocarditi(ebv,adenoviru, cmv, inf a,inf b...etc)e fino ad ora non ho mai avuto problemi, sono circa due mesi che invece facendo il controllo di estrazione(con primers di beta globina per il dna e con primers di gliceraledeide per RNA) su gel non vedo la banda. premetto che sia il dna che l'rna visti direttamente sui rispettivi gel senza fare pcr io li vedo, quindi ho un problema in pcr,dove non mi vengono neanche i controlli positivi. ho cambiato quasi tutto..ma ancora niente ..puo' essre un problema dovuto ad una contaminazione dell'enzima nucleasi o cosa? se qualcuno puo' aiutarmi gliene sarei greta, perche veramente non so piu' cosa fare.
grazie a chi potra rispondermi
Romina
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 12:14:49
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Scusa la domanda...
...hai seguito alla lettera il protocollo sul datasheet della tua taq?
Hai verificato le Tm (e quindi di annealing)dei primers?
Se proprio non riesci, prova ad usare il DMSO (se è solo una qualitativa che ti serve).
Se poi tutto dovesse andar male aggiusta il MgCl2.
Controlla bene la concentrazione del tuo DNA.
Se poi la taq ha subito troppi stress potrebbe non funzionare più...
insomma di cose da fare ce ne sono un sacco!
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romyna
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 12:47:20
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innanzitutto grazie per la risposta,
ho cambiato tutto, dntp, taq,rifatto le work solution dei primers, cambiato le pipette e anche macchina di pcr..non ho mai usato DMSO.. mi potresti dire come fare? lo metto in pcr? in che concentrazione?
Grazie |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2009 : 10:09:27
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Guarda...in realtà dovrebbe dirtelo il datasheet.
Se non c'è scritto va bene dall' 1-10%. Prova il 5%, così non dovrebbe darti troppe mutazioni.
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