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manuAng21
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2009 : 09:31:47
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salve a tutti..
sto scrivendo in cerca di aiuto riguardo una relazione di laboratorio..abbiamo fatto degli esperimenti con la pcr e la prof domanda di ricavare la quantita di dna ke è stata amplificata.I dati ke abbiamo ricavato sono questi:
-1° esperimento dna iniziale 1 microlitro dna finale 42 nanogrammi(5 kilobasi)
-2° esperimento dna iniziale 0,2 microlitri dna finale 33 nanogrammi (4 kilobasi).
Il problema è ke nn riesco a trovare nessuna possibile scala di equivalenza poichè ho quantità calcolate con due diverse unità di misura...esiste un modo per portare tutto a mcl o ng o kilobasi per verificare un amplificamento effettivo?
vi ringrazio moltissimo...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2009 : 11:27:35
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Stai facendo un po' di confusione!
I microlitri sono un unità di VOLUME, non di peso. La quantità di DNA sarà espressa in ng o in numero di moli o in numero di molecole (o derivati), ma non in microlitri (o derivati)!
In 1 microlitro tu puoi avere una qualsiasi quantità di DNA, dipende dalla concentrazione, ed è proprio questo che la tua prof vuole farti trovare!
La soluzione del problema sta nel pensare a come funziona la PCR.
Ad ogni ciclo della PCR tu raddoppi la quantità di DNA. Se parti da 100 molecole, dopo 1 ciclo ne hai 100 * 2^1 = 200, dopo 2 cicli ne hai 100 * 2^2 ... dopo n cicli ne hai 100 * 2^n IN TEORIA. Quindi IN TEORIA se alla fine hai 42 ng sai che
42 ng = x * 2^n dove n è il tuo numero di cicli e x è la quantità iniziale.
In pratica la cosa non è proprio così, e quella che calcoli con il passaggio precedente è una sovrastima, in quanto verso la fine la tua PCR non sarà più esponenziale, in quanto alcuni dei reagenti saranno consumati durante il processo.
Se vuoi avere una misura più corretta devi:
1) sapere la [] di tutti i reagenti
2) trovarne le moli
3) trovare quale è il reagente limitante
4) pensare se quel reagente basterà per gli n cicli che hai fatto (nel qual caso la formula di sopra funziona).
Vedi questa spiegazione (in cui affrontano il problema opposto)
http://www.madsci.org/posts/archives/2007-02/1172519702.Mb.r.html |
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