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morgan431
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 22 aprile 2009 : 11:25:33
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Salve a tutti 
Volevo sapere se qualcuno può aiutarmi con un protocollo di purificazione delle proteine. Vi dico che io lavoro in pianta quindi mi servirebbe qlc di inerente ma se avete altri protocolli posso cmq aggiustarli.
Devo riuscire ad ottimizzare i buffer...uffi uffi..tanti calcoli e tante prove...
Dai aiutatemi così magari riesco a finire prima la mia tesi e finalmente mi laureooooooooo 
Grazie a tutti...e rispondete in tanti  !!!!!!
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morgan431
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 22 aprile 2009 : 13:43:25
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Nessun consiglio per me????  ....
uffi come farò?  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 aprile 2009 : 14:06:12
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A volte bisogna attendere più di un'ora per avere una risposta...
Cosa intendi per "purificazione"? Vuoi purificare una proteina particolare oppure vuoi semplicemente estrarre le proteine?
Questo è il protocollo di estrazione che usavo in cellule di mammifero, immagino che lo potresti adattare, probabilmente la differenza principale sarà nella lisi.
http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=10 |
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morgan431
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 22 aprile 2009 : 14:07:40
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| Gtazie mille...cmq l'estrazione l'ho già fatta ora devo purificare per trovare la proteina che mi interessa... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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morgan431
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 22 aprile 2009 : 16:14:47
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wow..un sacco di protocolli!
il mio prob inoltre è sulla necessità e semmai quantità di imidazolo nei buffer usati per le colonnine...
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2009 : 11:40:35
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Che proteina stai purificando? Se devi usare l'imidazolo immagino che sia HIS taggata e che tu stia usando una colonnina al Nichel...e poi...devi purificarla in condizioni native o denaturanti?
In realtà se vuoi sapere le quantità di imidazolo (al posto dell'imidazolo puoi anche far variara il Ph della tua soluzione, dovresti fare delle prove e vedere qual'è il metodo più efficiente nel tuo caso) bisognerebbe vedere quanto è stabile il legame della proteina con il nichel.
Cmq, premesso che non so nulla delle condizioni del tuo esperimento ti posso dire che per purificare la mia proteina in condizioni DENATURANTI io facevo prima dei lavaggi con 10mM di imidazolo in aggiunta al buffer (8M urea, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris-HCl). Il volume per i lavaggi è di 10-15 volte il volume di resina usata (es: 1ml di resina...10-15ml di lavaggi). Riempi la colonnina, risospendi la resina delicatamente e fai eluire conservandio l'eluato . Dopo i lavaggi controllavo su gel colorato con coomassie colloidale il grado di purezza della proteina e se c'erano altri contaminanti. Se così era allora aumentavo la quantità di imidazolo fino a 25mM (perdevo un pò di proteina ma anche i contaminanti) usando però al max 10 volumi rispetto al volume di resina. Una volta ricontrollata su gel allora cominciavo ad eluire con 250mM di imidazolo, se la proteina non si staccava aumentavo a 500mM fino a 1,5M...dipende sempre da quanto forte sia il legame tra la tua proteina e il nichel
http://www1.qiagen.com/literature/Default.aspx?Term=protein+purification&Language=EN&LiteratureType=4%3b8%3b9%3b10&ProductCategory=0
Qui trovi vari protocolli e informazioni che possono esserti utili.
spero di non essere stata troppo confusionaria nella risposta |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2009 : 11:46:08
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| Dimenticavo un'informazione importante...il buffer era a Ph=8 e la mia proteina aveva un punto isoelettrico di 5.5 |
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