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morgan431
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4 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 11:25:33

Salve a tutti

Volevo sapere se qualcuno pu� aiutarmi con un protocollo di purificazione delle proteine. Vi dico che io lavoro in pianta quindi mi servirebbe qlc di inerente ma se avete altri protocolli posso cmq aggiustarli.
Devo riuscire ad ottimizzare i buffer...uffi uffi..tanti calcoli e tante prove...

Dai aiutatemi cos� magari riesco a finire prima la mia tesi e finalmente mi laureooooooooo

Grazie a tutti...e rispondete in tanti

!!!!!!

morgan431
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 13:43:25

Nessun consiglio per me????

....
uffi come far�?

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 14:06:12

A volte bisogna attendere pi� di un'ora per avere una risposta...

Cosa intendi per "purificazione"? Vuoi purificare una proteina particolare oppure vuoi semplicemente estrarre le proteine?

Questo � il protocollo di estrazione che usavo in cellule di mammifero, immagino che lo potresti adattare, probabilmente la differenza principale sar� nella lisi.

http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=10

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morgan431
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 14:07:40

Gtazie mille...cmq l'estrazione l'ho gi� fatta ora devo purificare per trovare la proteina che mi interessa...

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 15:56:27

In questo caso dipende molto dalla proteina che vuoi purificare.
Sicuramente un metodo cromatografico ti sar� utile, quale nello specifico dipende.
Potresti cominciare con una purificazione grossolana (es. per dimensione o per carica) per poi passare ad una purificazione specifica es. con una colonna con anticorpi.

Qui trovi un po' di protocolli:
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Extraction___Purification/index.html

Ovviamente guarda anche se in letteratura qualcuno l'ha gi� purificata.

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morgan431
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2009 : 16:14:47

wow..un sacco di protocolli!
il mio prob inoltre � sulla necessit� e semmai quantit� di imidazolo nei buffer usati per le colonnine...

angemore
Nuovo Arrivato

82 Messaggi

Inserito il - 26 aprile 2009 : 11:40:35

Che proteina stai purificando? Se devi usare l'imidazolo immagino che sia HIS taggata e che tu stia usando una colonnina al Nichel...e poi...devi purificarla in condizioni native o denaturanti?
In realt� se vuoi sapere le quantit� di imidazolo (al posto dell'imidazolo puoi anche far variara il Ph della tua soluzione, dovresti fare delle prove e vedere qual'� il metodo pi� efficiente nel tuo caso) bisognerebbe vedere quanto � stabile il legame della proteina con il nichel.
Cmq, premesso che non so nulla delle condizioni del tuo esperimento ti posso dire che per purificare la mia proteina in condizioni DENATURANTI io facevo prima dei lavaggi con 10mM di imidazolo in aggiunta al buffer (8M urea, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris-HCl). Il volume per i lavaggi � di 10-15 volte il volume di resina usata (es: 1ml di resina...10-15ml di lavaggi). Riempi la colonnina, risospendi la resina delicatamente e fai eluire conservandio l'eluato . Dopo i lavaggi controllavo su gel colorato con coomassie colloidale il grado di purezza della proteina e se c'erano altri contaminanti. Se cos� era allora aumentavo la quantit� di imidazolo fino a 25mM (perdevo un p� di proteina ma anche i contaminanti) usando per� al max 10 volumi rispetto al volume di resina. Una volta ricontrollata su gel allora cominciavo ad eluire con 250mM di imidazolo, se la proteina non si staccava aumentavo a 500mM fino a 1,5M...dipende sempre da quanto forte sia il legame tra la tua proteina e il nichel
http://www1.qiagen.com/literature/Default.aspx?Term=protein+purification&Language=EN&LiteratureType=4%3b8%3b9%3b10&ProductCategory=0
Qui trovi vari protocolli e informazioni che possono esserti utili.

spero di non essere stata troppo confusionaria nella risposta

angemore
Nuovo Arrivato

82 Messaggi

Inserito il - 26 aprile 2009 : 11:46:08

Dimenticavo un'informazione importante...il buffer era a Ph=8 e la mia proteina aveva un punto isoelettrico di 5.5

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