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apelge
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
 Inserito il - 23 aprile 2009 : 15:19:37
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salve sono nuova sia del forum che della western...
ho una domanda:
mi hanno dato questo protocollo per lisare le cellule.
prendo supernatant, metto in un 15ml falcon in ghiaccio
lavo le cellule, unisco il lavaggio al supernatant
trisinizzo...e metto sempre il tutto nel tubo
lavo e unisco il lavaggio alle cell
poi
centrifugo, butto via il supernatant, risospendo in 1 ml e passo tutto in un eppenderf da 1.5
centrifugo 10 sec e butto il supernatant
metto il buffer di lisi
bollisco 95 per 15 min
e posso frizzare
poi far'o la determinazione delle proteine.
Alcuni mi hanno detto che non dovrei denaturare le prot prima di determinarle...'e vero??
grazie a chiunque risponda!!!
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molecola84
Nuovo Arrivato
Prov.: ol
Città: ugan
88 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2009 : 11:40:01
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| SCUSA MA che cellule hai?le coltivi in piastra? |
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apelge
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2009 : 12:05:53
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Citazione:
Messaggio inserito da molecola84
SCUSA MA che cellule hai?le coltivi in piastra?
allora, si sono cellule di melanoma...le coltivo in 6-well plates...
alcuni well sono trattati con dei composti... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2009 : 12:50:08
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Scusa ma innanzitutto non si capisce cosa tieni a fare il surnatante e sopratutto perchè ci aggiungi il lavaggio! 
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
prendo supernatant, metto in un 15ml falcon in ghiaccio
lavo le cellule, unisco il lavaggio al supernatant
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
trisinizzo...e metto sempre il tutto nel tubo
si dice "tripsinizzare", ma poi perchè metti ancora tutto assieme?
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
lavo e unisco il lavaggio alle cell
poi
centrifugo, butto via il supernatant, risospendo in 1 ml e passo tutto in un eppenderf da 1.5
centrifugo 10 sec e butto il supernatant
ok
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
metto il buffer di lisi
bollisco 95 per 15 min
e posso frizzare
poi far'o la determinazione delle proteine.
Alcuni mi hanno detto che non dovrei denaturare le prot prima di determinarle...'e vero??
grazie a chiunque risponda!!!
Si in genere la lettura della concentrazione delle proteine si fa prima della denaturazione, poi denaturi quando metti nel "loading buffer" ("sample buffer"), in ogni caso la denaturazione non cambia la concentrazione. |
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apelge
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2009 : 14:12:47
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..che si dice tripsinizzare lo so ma era un errore di battitura...(un po di flessibilit'a no eh?)
il supernatant lo devo tenere perch'e ho cellule apoptotiche che si vanno staccando e siccome studio apoptosi non me le voglio perdere...
lo so che la concentrazione delle proteine non cambia con la denaturazione ma mi chiedevo se fosse giusto denaturarle senza il loading buffer...o se potessi avere problemi per il successivo passaggio di quantificazione con le proteine gi'a denaturate.
Scusate l'italiano zoppicante ma non scrivo in italiano da una vita...(vivo all'estero)
grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2009 : 23:11:33
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Citazione:
Messaggio inserito da apelge
..che si dice tripsinizzare lo so ma era un errore di battitura...(un po di flessibilit'a no eh?)
Beh non te la prendere così però! Non era certo un rimprovero!
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
il supernatant lo devo tenere perch'e ho cellule apoptotiche che si vanno staccando e siccome studio apoptosi non me le voglio perdere...
Ho chiesto spiegazioni solo perchè questo punto non era chiaro, non si capiva bene alla fine del protocollo che facesse quel surnantante.
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
lo so che la concentrazione delle proteine non cambia con la denaturazione ma mi chiedevo se fosse giusto denaturarle senza il loading buffer...o se potessi avere problemi per il successivo passaggio di quantificazione con le proteine gi'a denaturate.
Secondo il mio modesto parere è più giusto denaturarle quando le metti nel loading buffer, anche perchè potresti ad esempio non volerle utilizzare tutte o caricare sia proteine denaturate che non denaturate. Poi per alcune proteine ad es. non bisogna denaturare facendole bollire ma solo utilizzando SDS nel loading buffer. Tutto dipende dal tipo di esperimento che devi fare.
Io non le ho mai denaturate prima, ma non credo ti crei problemi per la quantificazione, in ogni caso se non sei sicura non sei obbligata a denaturale prima no?
Citazione:
Messaggio inserito da apelge
Scusate l'italiano zoppicante ma non scrivo in italiano da una vita...(vivo all'estero)
grazie
No problem! Io pure vivo all'estero! 
Comunque il forum è una community dove ci si confronta e se si danno consigli è solo per il piacere di farlo e di condividere le proprie esperienze e nessuno è mai tenuto a rispondere. Quindi non la prendere così sul personale.
In ogni caso Benvenuta su MolecularLab  |
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