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itwix
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 25 aprile 2009 : 10:12:23
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Sono nuova nel forum...ciao a tutti! 
mi dareste una mano? Sono nuova anche alla RTPCR! La GAPDH fatta su campioni differenti (trattati e non) non è uguale. Dovrei rifare il cDNA? oppure utilizzare housekeeping differenti? solo nel trattato è ridotta. Oppure si normalizza in altro modo che io ignoro?
Grazie mille!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 10:30:12
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| Se hai dei notevoli cambiamenti cambia housekeeping. Evidentemente il tuo trattamento influenza GAPDH (oppure la trascrizione in generale, nel qual caso non puoi farci più di tanto). Prova con 18S. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 10:55:36
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| Io usavo beta actina, ma il ribosomale dovrebbe essere più stabile |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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itwix
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 10:56:36
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Grazie mille chick80 . Proverò col 18S. Ma scusa se stresso questo argomento; alcuni(non nel forum) mi consigliano di dosare ("occhiometricamente! ) il cDNA sulla base della GAPDH fino a quando mi viene uguale in tutti i campioni e poi amplificare il mio target! Semmai il cDNA di tutti i campioni non fosse venuto bene, non sarebbe bene rifarlo anzicchè "dosarlo occhiometricamente"? Cosa mi consigliate?
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itwix
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 11:00:38
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Grazie mille Dionysos ,
La beta actina l'abbiamo esclusa perchè il trattamento apporta modifiche al citoscheletro. la provo comunque!!
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 12:24:54
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| Se il cDNA non è venuto bene l'unica cosa secondo me è rifarlo e basta e poi se (come appare evidente) la GAPDH è influenzata dal trattamento (perchè hai detto che ti si abbassa solo nei campioni trattati) non ha proprio senso continuare ad usarla per "dosare occhiometricamente il DNA" perchè allora nel campione trattato dovresti mettere più DNA e si falsa il risultato. Il tuo esperimento dovrebbe essere: a parità di DNA c'è differenza di espressione di un determinato gene (o più geni) tra i capioni trattati e non? Io come gene di controllo usavo ABL ma se cerchi in letteratura ce ne sono diversi, basta vedere quello che hai a disposizione in laboratorio e se è influenzabile dal trattamento (come ti è capitato per la GAPDH) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 12:38:08
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Io normalizzo con tre housekeeping, in molte pubblicazioni non accettano nenanche la normalizzazione con un solo housekeeping.
Se vuoi normalizzare con uno solo utilizza un gene ribosomiale che sicuramente sono più stabili. GAPDH non è affatto stabile e neanche beta-actina (come altre proteine del citoscheletro).
In ogni caso ti dico il modo corretto in cui bisognerebbe procedere, poi in pochi lo fanno.
Innanzitutto dovresti dosare il tuo RNA, retrotrascrivere uguali quantità e utilizzare le stesse quantità in real-time. Fai una real-time con diversi housekeeping in tutti i tuoi campioni, trattati e controlli (solo housekeeping non il gene di interesse) e selezioni i migliori housekeeping per il tuo caso. Esistono degli algoritmi apposta che ti permettono di fare questa analisi e di vedere quale housekeeping è più stabile: GeNorm
a questo punto selezioni il tuo/tuoi housekeeping e puoi procedere con l'analisi del gene di interesse e normalizzare su qualcosa che è veramente "housekeeping".
Per darti un'idea, questo è un bel lavoro (Italiano ) in cui si sono messi a valutare 10 housekeeping diversi e hanno visto che molti non sono affatto housekeeping.
Selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies in striped dolphin (Stenella coeruleoalba) skin biopsies.
Ti consiglio la lettura anche se molto probabilmente non lo farai sui tuoi campioni.
So che è molto lavoro e sicuramente dispendioso quindi in pochi lo fanno. Ma in ogni caso è interessante conoscere queste cose.
Io ho selezionato i miei 3 housekeeping in questo modo e comunque ho visto che quello più stabile è Rpl13, proteina ribosomale per l'appunto. Quindi il consiglio se devi scegliere un housekeeping solo e non puoi permetterti di fare tutto il lavoro di selezione è di scegliere comunque un gene ribosomale che comunque in teoria è più stabile.
Ah dimenticavo... benvenuta su MolecularLab!  |
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itwix
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2009 : 15:32:27
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Grazie mille GFPina per i tuoi consigli e per gli omaggi della casa!
Essere in forum comincia a piacermi! Spero di essere utile e non di utilizzarlo per chiedere solamente!
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Normalizzare una RTPcr
Didattica
