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carlo.m
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 01 maggio 2009 : 18:54:44
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Ciao a tutti.
L'altro giorno in lab ho precipitato del DNA plasmidico con il classico protocollo dell'acetato di sodio ed etanolo.
Quando ho risospeso il DNA in acqua, la soluzione invece che essere chiara era lattescente, diciamo un pò come l'orzata.
Inoltre la purezza è scesa da 1,90 a 1,48.
Secondo me questo fatto è dovuto a troppi sali rimasti; d'ora in avanti farò bene a lavare due volte in etanolo 70%.
Secondo voi è corretta questa mia diagnosi o non sono stati i sali rimasti a causare il problema?
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2009 : 08:59:31
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La colorazione lattescente in genere la si ha aggiungendo l'alcool in acqua,il tuo caso mi pare strano visto che hai risospeso un pellet,hai usato un kit per fare l'estrazione?.
In genere è preferibile usare Isopropanolo ,sebbene alcuni usano etanolo per precipitare gli acidi nucleici...ma per ragioni chimico-fisiche a mio parere, va meglio il primo e usalo al 100% ,in oltre che [ ] di sali hai utilizzato?
nel senso...
Per quanto riguarda la purezza,ovviamente ti riferirai al rapporto 260/280,ed effettivamente e' abbastanza impuro,quindi penso che ci sia qualche errore a monte durante l'estrazione,considera che i sali precipitano anche le proteine..successivamente fai i lavaggi in etanolo |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2009 : 17:14:23
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una soluzione lattescente dopo l'alcool è compatibile con una grossa quota di sali che precipitano in alcool 70%.
Non credo che 2 lavaggi con alcool 70% riesca a toglierti tutti quei sali, certo che dipende dal volume, una cosa è lavare con 1 ml di alcool, un'altra con 100 ul.
La solubilità dei sali in alcool 70% è piuttosto scarsa, serve per togliere qualcosina, ma non sarei tanto sicuro che nel tuo caso riesca a togliere tutti quei sali, forse dovresti farne di più e con volumi più abbondanti di alcool, magari come da protocollo, ovvero rompere il pellet, e poi ricentrifugare al massimo per un bel po' di tempo, così hai più possibilità che il sale si disciolga bene.
La formazione lattescente è compatibile anche con altre cose che contaminano il campione, esempio tante proteine, membrane, saponificanti etc, ma se sei sicuro che ci siano solo sali allora è probabile che sia quello.
Dubito, anche se non ne sono sicuro, che i sali assorbano nel range 260-280, invece il fenolo e le proteine sicuro.
P.S.: Forse patrizio si riferiva all'aggiunta di Alcool in acqua di fontana, dove causa la precipitazione dei carbonati in esso contenuto... Le miscele di acqua distillata pura ed alcool sono sempre incolori e omogenei.
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Il_Lup
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2009 : 19:44:36
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| MA sei sicuro di non aver fatto errori di spipettamento prima della precipitazione? può essere che ti sei portato dietro qualcosa nei passaggi precedenti |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2009 : 07:47:44
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| Neuroscienze mi sono spiegato male, e' da un po' che non la faccio ...ma in genere precipito aggingendo i sali nella soluzione data dai reagenti del kit di estrazione e poi isopropanolo,e ricordo una reazione del genere,appunto ho chiesto anche che [ ] di sale avesse utilizzato |
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