| Autore |
Discussione |
|
|
biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
 Inserito il - 17 maggio 2009 : 18:07:48
|
ciao a tutti,
sto facendo un progetto (del tutto inventato perchè mi serve solo per dare una parte di esame) per la costruzione di un topo knock-in inducibile con il sistema tet-off; e fino a qui non ho problemi. Per fare i miei controlli devo effettuare una serie di PCR. La mia domanda è: è possibile amplificare uno stampo che supera le 4000 bp?
Grazie.
|
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2009 : 18:44:57
|
| Hmmm... forse con una RACE, ma perchè vorresti farlo scusa? Se devi solo fare delle PCR di controllo per vedere se il gene si è integrato non hai bisogno di amplificare TUTTO il gene... |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2009 : 21:33:41
|
Più che altro si utilizza una Long PCR che ti permette di amplificare frammenti più lunghi che una PCR normale.
Al posto della TAQ viene utilizzato un enzima con attività di proofreading che quindi è in grado di eliminare le basi mal accoppiate, questo perchè l'incorporazione di basi sbagliate porta ad una diminuzione dell'efficienza. In genere comunque si tende ad utilizzare una mix di enzimi in cui è presente sia la TAQ normale che una polimerasi proofreading, questo consente di avere una elevata processività grazie alla TAQ e una attività di proofreading appunto che rende il tutto più efficiente e ti consente di amplificare frammenti molto più lunghi.
In realtà 4Kb non è un frammento così elevato, ci potresti riuscire anche con una semplice TAQ, anche se raggiunge il limite massimo per questo enzima.
Poi mi associo a chick80,
Citazione:
Se devi solo fare delle PCR di controllo per vedere se il gene si è integrato non hai bisogno di amplificare TUTTO il gene...
per quale motivo vuoi amplificare un frammento di 4kb? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2009 : 22:17:06
|
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
ah vedi, la long PCR mi mancava!
 si scopre sempre qualcosa di nuovo!  |
|
|
|
biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2009 : 21:19:41
|
si lo so...il problema è che il mio topino ce l'ha già il gene...quindi devo amplificare qualcosa che mi assicuri che il gene sia quello inserito da me (tipo posso amplificare la giunzione con la GFP) e poi tutto il resto con le flanking per capire che si avvenuta la HR in modo specifico...quello che devo ottenere in pratica è che il gene normale del topo sia sostituito dallo stesso gene che però è fuso alla gfp, controllato dal promotore TRE e che porti anche il gene per la Neo...cmq si alla fine era solo curiosità, per sapere se era possibile fare tale PCR. Posso benissimo fare una PCR in più, oppure risolvere il problema del riconoscimento della giunzione promoter-gene.
Grazie cmq di tutto, siete stati gentilissimi.
Ciao. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2009 : 21:43:16
|
Scusa, ma continuo a non comprendere il design dell'esperimento...
Che senso ha avere la proteina sia normale che fusa a GFP? Non capisco a cosa possa servire... |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2009 : 00:00:42
|
Credo che intendesse che sostituisce il gene endogeno con il gene codificante per la stessa proteina ma fuso con la GFP!
In ogni modo biologomolecolare84, di solito si va a vedere se è presente la cassetta associata al transgene, ad es qua potresti andare a vedere se c'è la sequenza per GFP.
Un altro metodo, che ora difficilmente si usa, ma giusto per informazione mi sembra corretto indicare, è fare un Southern Blot. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2009 : 07:35:51
|
Citazione:
Credo che intendesse che sostituisce il gene endogeno con il gene codificante per la stessa proteina ma fuso con la GFP!
Beh, in quel caso basta vedere se c'è GFP... :)
E poi ovviamente c'è tutta la caratterizzazione da fare per via immunologica (Western, immunoistochimica etc) e fisiologica (i topi sono "normali"?) |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2009 : 13:11:15
|
Sostituisco la proteina normale con quella fusa alla GFP perchè è questa che viene controllata dal promotore TET/OFF...quindi ogni volta che localizzo la GFP, localizzo la mia proteina la cui espressione è controllata dall'aggiunta o meno della Dox, per questo non credo basti vedere che ci sia la GFP in quanto la ricombinazione omologa potrebbe avvenire in siti non specifici e non dell'intero costrutto...io voglio essere sicuro che la mia cassetta sia stata inserita interamente e dove voglio io (devo sostituire il gene endogeno)...certo GFPina avevo già pensato al SB e, giustamente, come dice chick80, anche al WB e immunoistochimica...
 siete sempre molto gentili,grazie davvero. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2009 : 15:12:31
|
Scusate un attimo però, siccome la domanda era "si può fare una PCR per un frammento maggiore di 4Kb" io ho risposto a quella e dato per scontato tutto quello che riguarda la creazione del topo transgenico.
Ma a questo punto rileggendo i successivi interventi mi sfugge una cosa, biologomolecolare84 ma tu la PCR per vedere se il tuo topo è transgenico la vorresti fare sul topo?
In realtà la selezione si fa prima, sulle cellule ES ed utilizzi dei marker di selezione positiva e negativa.
Come marker si selezione positiva utilizzi quello per la resistenza ad un antibiotico, ad es tu metti la NEO
Citazione:
quello che devo ottenere in pratica è che il gene normale del topo sia sostituito dallo stesso gene che però è fuso alla gfp, controllato dal promotore TRE e che porti anche il gene per la Neo
e fin qua ci siamo, selezioni le cellule in cui è avvenuta ricombinazione grazie alla resistenza alla Neomicina.
Però per valutare se c'è stata ricombinazione omologa utilizzi anche un marker di selezione negativa, in genere la timidina kinasi (TK) che codifica per un enzima in grado di trasformare il ganciclovir nella suo forma tossica. Essendo TK lontano dal gene che vuoi inserire + neo, se avviene ricombinazione omologa questo sarà escluso quindi dando ganciclovir le cellule sopravvivono. Se invece avviene ricombinazione non omologa può essere inserito, a questo punto viene prodotta TK e le cellule in presenza di ganciclovir muoiono.
Qua c'è una spiegazione chiara con tanto di disegni: http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/homolrecomb.html
In questo modo le cellule ES che selezioni sono "solo" quelle in cui è avvenuta ricombinazione omologa.
In realtà non è sicuro al 100% ma puoi comunque fare dei controlli mediante PCR, in questo caso però come abbiamo detto in precedenza non amplifichi comunque tutto il pezzo, ma fai una PCR per vedere se hai avuto integrazione del costrutto (ad es. utilizzando GFP o Neo) e una seconda PCR per vedere se la ricombinazione è omologa.
Mettere a punto una "long PCR" a questo scopo sarebbe un'inutile perdita di tempo. Con 2 PCR te la cavi molto più in fretta!!! 
Scusa, magari ho ripetuto cose che sapevi già, ma meglio specificare, se non altro potrà essere utile a qualcun altro!
 |
|
|
|
biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2009 : 15:35:04
|
| i controlli vanno fatti nelle ESC e poi le cells positive si impiantano nella blastocisti di una madre adottiva pseudopregnante, giusto?...si hai ragione, infatti la dmnd era più che altro per curiosità. Certo facendo 2 PCR alle giunzioni promoter-gene e gene-GFP e con controlli positivi e negativi, che avevo già previsto (ma a voi non ne avevo parlato) dovrei riuscire. |
|
|
| |
Discussione |
|
Capacità polimerasi PCR
Didattica
