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jammina
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 17 maggio 2009 : 21:20:38
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ciao a tutti ,devo fare l'esame di tecnologie ricombinanti,sul programma c'e' scritto: Genotipizzazione: ASH , ASA , COP-PCR e altre cose di cui ho la spiegazione.qualcuno potrebbe spiegarmi queste tre metodiche dato che nn riesco a trovarle da nessuna parte.....grazieeeeeeee
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2009 : 23:23:49
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Allora per quanto riguarda ASH e ASA stanno per:
ASH = Allele Specific Hybridization
ASP = Allele Specific Amplification
e detto in breve sono:
Allele-specific hybridization (ASH)
Ibridazione allele specifica.
Si fa un Southern blot del DNA genomico (o di frammenti amplificati mediante PCR) di un individuo utilizzando delle sonde complementari all’allele wild type e al mutante in questo modo in base al pattern di ibridazione ottenuto si può stabilire il genotipo dell’individuo in questione.
In base a come vengono disegnate le sonde e alle condizioni stringenti utilizzate è possibile discriminare anche SNPs.
Allele-specific amplification (ASA)
Amplificazione allele specifica.
Si amplifica il DNA target mediante PCR in condizioni fortemente stringenti utilizzando dei primers specifici per l’allele WT e per il mutato accoppiati con un primer comune, solo il primer che si appaia perfettamente con lo stampo sarà in grado di dare l’amplificato mentre quello che presente mismatch non darà luogo ad alcun amplificato, in questo modo è possibile discriminare quale allele è presente e risalire al genotipo.
Puoi trovare altro cercando i nomi completi.
La COP-PCR sta per: Competitive Oligonucleotide Priming–PCR
per questa dovrei cercare però perchè non la conosco! |
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jammina
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 17 maggio 2009 : 23:28:54
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grazie . . . .veramente gentile!!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2009 : 14:43:43
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Allora ho avuto un attimo di tempo per cercare...
la COP-PCR (Competitive Oligonucleotide Priming–PCR)
è simile alla ASA, la differenza sostanziale è che i due primers sono messi nella stessa reazione (a differenze della ASA in cui hai 2 reazioni distinte), il funzionamento è questo:
Si utilizzano due primers specifici per ogni allele (WT e mutato) più un primers comune. Il primers specifico sarà avvantaggiato a legarsi allo stampo rispetto a quello che presenta il mismatch, i due primers di fatto "competono" per il legame al DNA (da qui il nome "competitive").
Il risultato è una banda di lunghezza esattamente uguale per il WT e per il mutato, quindi con una semplice elettroforesi non vedi assolutamente alcuna differenza.
Il trucco è quello di utilizzare primers marcati. La metodica originale prevedeva l'utilizzo di uno dei due primer marcato radioattivamente, quindi esponendo il gel ad una lastra autoradiografica sulla lastra compare solo la banda in cui è stato incorporato il primer marcato. Il problema però era che risultava impossibile distinguere tra omozigote e eterozigote.
Adesso si utilizzano primers marcati differentemente, ad es. con 2 fluorofori diversi.
L'articolo originale di questa tecnica è questo: Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming.
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