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King D
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Acerra
98 Messaggi |
 Inserito il - 20 maggio 2009 : 19:39:34
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Salve a tutti!
Ho dei dubbi riguardo la tecnica dell'SSCP, soprattutto dopo aver letto alcuni topic su questo forum e seguito le lezioni all'uni. Allora, come dal nome, l'analisi riguarda ssDNA ed è in grado di analizzarli grazie alla variazione della loro mobilità elettroforetica (e su questo mi trovo) poi, sui miei appunti questo ho segnato, l'analisi elettroforetica avviene in condizioni NON denaturanti e nel loading buffer c'è una sostanza che provvede a mantenere i frammenti separati. Man mano che la corsa procede, il denaturante non migra, e i filamenti si riappaiano in base alla loro conformazione. In questo modo, i dsDNA andranno a disporsi in basso e, i frammenti denaturati, si disporranno lungo il gel in base alla loro conformazione.
Anche sulle slides della mia prof.sa non appaiono notizie riguardanti temperatura e uso di sali... tra le quali appare anche questa foto:
Qualcuno può chiarire?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2009 : 20:44:55
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Diciamo che il principio su cui si basa l'SSCP è tutto quello detto sopra (e in altri topic)
- denaturazione (ad alta temperatura o con agenti denaturanti)
- "blocco" dei filamenti in forma denaturata (ad es. mettendo subito in ghiaccio)
- elettroforesi in condizioni non denaturanti, altrimenti non avresti più la formazione di strutture secondarie che permette ai singoli filamenti di avere una caratteristica conformazione
In questo modo osservi un pattern su gel che è caratteristico per ogni singolo filamento.
Essendo il gel in condizioni non denaturanti può succedere che parte del DNA si riappai e formi il doppio filamento che migra più velocemente quindi lo vedi sul fondo del gel, ma in genere questo non si considera perché non ti dice assolutamente niente, le bande informative sono quelle dei singoli filamenti.
Poi riguardo alla "sostanza" che viene messa nel loading buffer, non saprei a cosa si riferisca, formammide? urea? sali?
In ogni caso sostanza misteriosa o meno, questo è l'andamento dell'elettroforesi su gel.
Spero sia più chiaro.
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King D
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Acerra
98 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2009 : 16:47:46
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Infatti! Il problema era questa sostanza "oscura" presente nel buffer e poi, quelle bande non denaturate, mi avevano farto sorgere alcuni dubbi!
Comunque, tutto chiaro. Grazie mille!  |
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