problema con sequenza

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saras
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Citt�: como

27 Messaggi

Inserito il - 27 maggio 2009 : 23:44:34

ciao a tutti
ho un problema con una piccola sequenza di DNA. Devo sequenziare un prodotto di circa 280bp (premetto che non ho molta esperienza in sequenze). Amplifico, purifico con un kit della QiAGEN, faccio la reazione di sequenza uso primers piu' interni rispetto a quelli per l'amplificazione) come descritto dal manuale Applied Biosystems (uso il Big Dye Termin.) e purifico con colonnine Centrisept.
La sequenza parte bene (piu o meno

) e subito decade il segnale..si vedono piccoli picchi larghi e svrapposti (una schifezza)!
Ho fatto diverse prove: nuovo kit, nuove colonnine, ho cambiato il capillare..ma niente!
Qualcuno puo' darmi una mano???Grazie mille

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 28 maggio 2009 : 16:59:28

Domanda sicuramente stupida: quando utilizzi il Big Dye Term. sei sicura di marcare la quantit� giusta di DNA? Controlla sul dataSheet...

mak_steon
Utente Junior

138 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2009 : 12:03:33

Prova a mandarlo a sequenziare dopo tutto il processo di purificazione.
Almeno, oltre ad avere la sequenza, puoi capire se il problema sta nel sequenziamento vero e proprio o nella preparazione del campione.