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elenadd
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
 Inserito il - 03 giugno 2009 : 20:24:18
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ciao a tutti volevo chiedervi quali sono i vantaggi di usare ricombinazione omologa piuttosto che inserziona random?? grazie a tutti anticipatamente 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2009 : 22:01:55
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| Potresti spiegare meglio a cosa ti riferisci? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2009 : 00:41:25
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Ti riferisci alla creazione di animali transgenici/knock-in?
O altri modelli ? (lieviti, colture ex vivo ecc.) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2009 : 08:17:01
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| Ad ogni modo un ovvio vantaggio è che nella ricombinazione omologa sai dove va a finire il tuo gene, nell'inserzione random no, quindi inserendo il tuo gene puoi andare effettivamente a fare il KO di qualcos altro. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2009 : 09:32:32
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Citazione:
un ovvio vantaggio è che nella ricombinazione omologa sai dove va a finire il tuo gene
Ci sono anche vantaggi non indifferenti relativi
al rescue del controllo endogeno dell'espressione,
e al controllo del copy number, ma questo solo se
inserisci (knock-in) il gene. Qui si parla di KI o KO ? |
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elenadd
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 01:18:17
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mi riferivo ai vantaggi di usare ricombinazione omologa piuttosto che inserziona random per Topi transgenici per knock-out ...scusate l imprecisione |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 02:25:04
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Non per fare il rompiscatole... ma di imprecisione ce n'è
un 'altra: "topi transgenici per knockout" è una contraddizione
in termini, perchè i due termini sono esattamente opposti.
-> Transgenico: ha un gene in più (+esogeno)
-> Knockout: ha un gene in meno (-endogeno)
Poi c'è da distinguere i cosiddetti organismi
transgenici in due tipi, a seconda del metodo usato:
Se usi la ricombinazione omologa per inserire un transgene,
allora l'animale non si chiama propriamente "transgenico"
perchè non aggiungi copie ulteriori, ma rimpiazzi solo una
sequenza endogena con una transgenica. Si dice "knock-in".
Se invece aggiungi un segmento genico eccedente rispetto al resto
del genoma e fai in modo che si verifichi un'inserzione genomica
affidandoti a integrazioni casuali oppure ad un vettore virale
integrante (di solito lentivirus, coi vecchi retrovirus non puoi:
perdi l'espressione perchè vengono metilati) allora si può parlare
in modo ortodosso di organismo transgenico.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 07:28:15
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| La linea è molto sottile a mio parere... puoi generare un topo knock-out facendo un knock-in di un altro gene esogeno (generando a tutti gli effetti un topo transgenico) per ricombinazione omologa su di un gene endogeno. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 11:34:47
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Citazione:
La linea è molto sottile a mio parere... puoi generare un topo knock-out facendo un knock-in di un altro gene esogeno (generando a tutti gli effetti un topo transgenico) per ricombinazione omologa su di un gene endogeno.
Verissimo, c'è questa possibilità, però tradizionalmente con il KO
si usano costrutti "disrupting" mentre con il KI si può evitare di
distruggere il locus endogeno. Poi è anche vero che i costrutti
disrupting, inserendo geni di resistenza come NeoR, è come se
facessero un knock-in per il gene NeoR, ed è anche vero che
talvolta si fa un KI in un locus 'safe' per fare overlapping
e di fatto si 'rimpiazza' un locus endogeno, che viene perso.
Pensavo solo di chiarire il concetto generale, e comunque
di distinguere dal transgenico, che è un'altra cosa. |
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elenadd
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 18:20:10
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scusate forse non sono stata chiara ma il mio dubbio era riguardo i vantaggi di usare una ricombinazione omologa piuttusto che un inserzione random ..per quanto riguarda la precisazione "topi transgenici per knockout " ...ho preso questa frase dal titolo della slide del mio prof , cmq a questo punto credo che lui con quel titolo intenda semplicemente topi knockout... spero possiate darmi una mano  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 01:08:44
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Si scusa in effetti siamo andati un po' off topic!
(anche se in realtà non troppo)
Comunque una risposta chick80 te l'aveva data:
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Ad ogni modo un ovvio vantaggio è che nella ricombinazione omologa sai dove va a finire il tuo gene, nell'inserzione random no, quindi inserendo il tuo gene puoi andare effettivamente a fare il KO di qualcos altro.
Comunque per fare un KO, si fa la ricombinazione omologa! Devi sostituire il tuo gene con un gene KO, se facessi una inserzione random semplicemente non funzionerebbe! Avresti ancora il gene normale!
Come spiegava anche il link che ti ho indicato, per topi transgenici si utilizza l'inserzione random, per i KO la ricombinazione omologa!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 03:05:03
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Sì, direi che sui meccanismi ti abbiamo ampiamente risposto,
per cui avrai capito che il knockout è un'esclusiva della
ricombinazione omologa, mentre il trasferimento di geni
prevede sia la ricombinazione omologa che il random inserting.
Sui vantaggi& svantaggi, facendo sommario:
Vantaggi della ricombinazione omologa (knockout o knockin che sia)
- sai dove va a finire il tuo costrutto
- sai quante copie del costrutto integri (una per ogni corredo aploide)
- sai se il tuo costrutto integrerà in un luogo
in cui l'espressione genica è attiva e/o controllata
in modo ben preciso (magari tessuto-specifico)
Svantaggi della ricombinazione omologa:
- non puoi integrare più di una copia per corredo aploide
- l'efficienza d'integrazione è bassissima
per cui devi operare selezione (per cui
devi inserire nel tuo costrutto un marker)
- Il tuo costrutto verrà espresso solo
quando il locus d'integrazione sarà
epigeneticamente attivo, non prima, non dopo.
Vantaggi dell'inserzione random
- puoi inserire copie multiple (vector copy numbers multipli)
- puoi costruire una cassetta regolabile a tuo piacimento
quindi costitutiva, inducibile, tessuto-specifica, ecc.
in modo noncurante del particolare contesto epigenetico
- hai una maggiore efficienza di integrazione,
specie se usi i lentivirus (per cui non hai
bisogno di operare una selezione)
Svantaggi dell'integrazione random
- impossibilità di colpire loci specifici:
puoi solo aggiungere materiale genetico, non toglierne
- causalità e imprevedibilità dell'effetto di posizione
- rischio di mutagenesi inserzionale & genotossicità
- rischio di silenziamento epigenetico delle copie integrate
(caso dei retrovirus nelle ESC murine)
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elenadd
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 14:12:50
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| grazie mille! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2009 : 20:46:47
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raga magari mi potreste spiegare l'utilizzo dei BAC come tecnica per ottenere delle linee transgeniche?
nn capisco bene che utilizzo debba farne:
prendo il BAC ci inserisco un grande frammento di DNA che conterrà il mio gene di interesse e le sue sequenze a monte e a valle che io presumo siano sequenze regolatrici,lo faccio ricombinare (in un batterio con ricombinasi)con un plasmide prtanete GFP.
la GFP quindi mi prende il posto del gene di interesse e valuto la sua espressione,poi?cioè finisce quì oppure il bac con la GFP integrata lo devo trasfettare in cellule di blastocisti o altro....mah!help :D |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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ricombinazione omologa vs inserzione random
Didattica e Relazioni
