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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
 Inserito il - 04 giugno 2009 : 11:40:49
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ciao ragazzi e ragazze di molecularLab
ho un problemino con un argomento che nn riesco proprio a capire chi mi aiuta? vi spiego: facendo la mutagenesi in genetica la mia prof ci ha parlato di questo metodo per mutagenizzare
In pratica io so che il doppio mutante dut-ung- in questione è E.coli e so che la mutazione dut- fa avere accumulo di dUTP e quindi di uracile nel DNA e che ung- è la mutazione per cui questo accumulo non viene riparato
a questo punto inizia il mio problema e cioè
la sintesi del filamento mutagenizzato di DNA parta da un filamento stampo di un fago cresciuto in E.coli doppio mutante, il fago è M13
la teoria dice che: nel fago m13 si avranno all'incirca 20-30 u ogni circa 8000 basi e sarà usato il filamento di dna come stampo per sintetizzare un filamento mutante che non contiene uracile.
avremo così un DNA costituito da un wild type con uracile e u mutante senza uracile.
cosa significa? come si ottiene sta cosa?
continua dicendo: tale dna a doppio filam sarà inserito per trasformazione in E.coli ung+ che sarà capace di rimuovere gli uracile lasciando nello stampo siti vuoti che per tanto renderanno lo stampo biologicamente inattivo.
qst seconda parte presa da sola l'ho capita ma è la prima parte che nn riesco a capire cosa significa! chi mi aiuta?
http://www.pesolelab.it/sections/05_Courses/05_AA2008-2009/01_LBM/01_MD/5%20Mutagenesi.ppt#267,9,Diapositiva 9
in questa diapositiva c'è esattamente quello che io vorrei qualkuno m rendesse più chiaro
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2009 : 21:34:16
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A me sembrano chiare le slide, non so bene dove sia il tuo dubbio, comunque provo a rispondere:
Citazione:
Messaggio inserito da prossima biologa
avremo così un DNA costituito da un wild type con uracile e u mutante senza uracile.
cosa significa? come si ottiene sta cosa?
Tu ottieni un ssDNA (DNA a singolo filamento) contenente uracile, e questo penso sia chiaro.
Estrai il ssDNA e lo fai appaiare con un primer mutato (in vitro) il primer verrà esteso e ottieni il secondo filamento mutato. A questo punto hai un dsDNA con filamento WT con Uracile e filamento mutato senza uracile... da qui in poi mi sembra tu l'abbia capito...
dimmi se ci sono altri dubbi!
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 12:39:29
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quindi chiedo è il primer mutato che non contiene uracile? è in questo che consiste la mutagenesi in questo caso? l'estensione del primer mutageno avviene in vitro o nelle cellule? se avviene nelle cellule mi rimane il dubbio: perchè il nuovo filamento nn avrà uracile?le cellule piastrate non sono sempre dut-ung-?
perchè può sembrare una frase sciocchina ma... io è questo che nn ho capito.
per il resto grazie GFPina
mi sembra tutto molto più chiaro. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2009 : 13:19:36
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Mi sembrava di averti già risposto!
Ma forse non sono stata abbastanza chiara...
Citazione:
Messaggio inserito da prossima biologa
quindi chiedo è il primer mutato che non contiene uracile?
Non solo il primer ma anche i dNTPs che utilizzi!
Citazione:
Messaggio inserito da prossima biologa
è in questo che consiste la mutagenesi in questo caso?
La mutagenesi consiste in tutto il processo, comunque il fatto è che utilizzi un primer con una mutazione
Citazione:
Messaggio inserito da prossima biologa
l'estensione del primer mutageno avviene in vitro o nelle cellule?
Come dicevo prima "in vitro"!
Citazione:
Messaggio inserito da prossima biologa
se avviene nelle cellule mi rimane il dubbio: perchè il nuovo filamento nn avrà uracile?le cellule piastrate non sono sempre dut-ung-?
Detto che il passaggio di estensione nel primers avviene in vitro, poi però metti il plasmide in cellule dut+ ung+ in modo che il filamento con uracile (WT) venga degradato e quello mutato senza uracile venga replicato, ovviamente senza incorporazione di Uracile.
Se guardi questa vecchia discussione è indicato anche un link dove forse le figure sono più chiare: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=7191
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 16:48:58
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grazie gfpina...
senti ma se volessi salvare questa discussione nei preferiti come ho letto da qualke parte che si può fare, cm devo fare?cioè io aggiungo a preferiti...ma poi nn so cm trovarla. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Discussione |
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mutazione mediante selezione dut-ung- come si fa?
