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Sandrus86
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
 Inserito il - 05 giugno 2009 : 12:14:11
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Ciao a tutti innanzitutto... dunque è da un paio di mesi oramai che cerco di fare di tutto per amplificare un frammento di un gene...
Vi descrivo un po' il mio iter e quello della collega che prima di me si è posta il problema...
Dunque i primer scelti inizialmente avevano delle Tm leggermente diverse ma funzionavano discretamente intorno ai 58-60°. di punto in bianco non hanno più funzionato alla mia collega, e sono stati riordinati con la stessa sequenza. il problema si è riproposto dopo poche settimane. Quando ho preso in mano io il protocollo ho ritenuto opportuno ordinare dei nuovi primer, con delle temperature di melting più simili fra loro...
abbastanza fiducioso inizio a fare delle pcr di prova: 60°: banda nettissima in TBE2%, della lunghezza attesa... ma resa bassa da poter pensare di mandare in sequenza.
Ho cominciato a diminuire di grado in grado la temperatura di melting e sono arrivato a 53 gradi... la banda era sempre netta ma la resa non aumentava.
ho provato ad aggiungere BSA (se non sbaglio al 2 o 3 %) ma la situazione non è migliorata.... hot start, elongation finale, e trucchetti simili non sono serviti a migliorare la resa.
ora di punto in bianco non esce più niente: ho pensato a un danneggiamento delle aliquote di primer, ma anche rifacendole non ottengo amplificazione.... Tp, MgCl2, dNTPs... ecc funzionano perchè con altre pcr (condivido i reagenti con un collega... ah il risparmio) l'amplificazione avviene....
ora non so più dove andare a parare... pensate ho cominciato persino a pensare che la mQ con cui ho risospeso i primer potesse essere contaminata da batteri o da qualche DNAsi che mi mangiasse i primer... perchè non è possibile che spariscano così nel vuoto! cioè non vedo nemmeno una bandina sfocata nell'elettroforesi ad indicarmi che i primer non sono stati utilizzati.... non so più cosa pensare!
voi che fareste? salvo rivolgersi a san culo ovviamente :D
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 12:19:22
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Per quanto riguarda la resa, non potevi aumentare il numero di cicli o la quantità di stampo?!
Sei sicuro che non ci siano lì dentro i primer? Hai letto allo spettrofotometro? Né nelle aliquote né in quella di partenza? Non può essere che è il tuo stampo a degradarsi dopo varie settimane? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Sandrus86
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 12:36:53
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Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Per quanto riguarda la resa, non potevi aumentare il numero di cicli o la quantità di stampo?!
no sono già a 30 cicli e la taq più di quelli non è che ce la fa.... e sto già lavorando con 0,3 µg di DNA.. ho provato anche ad aumentare un po' ma non ho ottenuto risultati apprezzabili.
l'unico sarebbe una nested ma vorrei evitare di replicare ogni volta la pcr perchè una volta perfezionato il protocollo i campioni diventeranno tanti
Citazione:
Sei sicuro che non ci siano lì dentro i primer? Hai letto allo spettrofotometro? Né nelle aliquote né in quella di partenza? Non può essere che è il tuo stampo a degradarsi dopo varie settimane?
No ovviamente non ho letto... dicevo che i primer sembrano quasi essere spariti nel senso che non danno amplimero ma non rimangono nemmeno sul gel (come quando capita a volte se sono troppi che migrano in basso nel gel).
riguardo il dna, ho già provato 2 campioni, senza dubbio devo fare altre prove, non ho ancora avuto modo, ma intanto mi informo.
ciò che mi preme è senz'altro aumentare la resa! poi per riprendere ad amplificare qualcosa penserò e proprio male andando riordinerò i primer (ma devo fare ancora molte prove per escludere ogni ipotesi)...
se avete idee per la resa... fatemi sapere |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2009 : 13:35:25
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considera la possibilità, seppur remota, che quella piccola banda su gel possa essere stata tratta da una contaminazione di qualche soluzione o della pipetta stessa.
Ora magari hai pulito le pipette o la contaminazione è oramai troppo rovinata per poter dare dei risultati visibili.
Per quanto riguarda la resa e la ripetibilità dell'esperimento, talvolta ho avuto anche io questo problema e diverse persone che conosco. In genere risolvo riordinando i primers, decontaminare le pipette (le parti in plastica) in NaOH 0,1 N e SDS 0,1% o.n., cambiando le soluzioni ed usando quantità di DNA diluite per evitare sporcizie. I nucleotidi meglio se nuovi, o comunque che non hanno subito più di 3-4 scongelamenti ed usa il protocollo di PCR standard.
Il fatto che ai tuoi colleghi venga bene la PCR significa solo che il loro protocollo è molto più robusto del tuo e quindi viene bene anche se ci può essere qualche piccola variazione. Il tuo magari è molto più delicato.
Ad ogni modo 30 cicli non è poi tanto per una taq o pfu, puoi arrivare benissimo almeno a 35
in bocca al lupo
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Sandrus86
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2009 : 19:20:40
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dunque... torno dopo un paio di prove: (le concentrazioni sono a memoria... spero di non aver scritto scemenze)
- cambio tampone (il vecchio era finito)--> nulla
- cambio dna: nulla
- nuove aliquote di primer: nulla. e i primer ci sono perchè ne ho caricato 1 µg su TBE e c'erano
- cambio dNTP: nulla
- 2 taq di diverse aliquote: nulla
l'ultima prova che ho fatto ho usato questo profilo
Tp 1x
MgCl2 2,5 mM
dNTP 0,25 mM
DNA 0,3 µg
(0,5 µl di taq di cui non ricordo la concentrazione... mi sa cmq ne ho messo 2,5 U... non ricordo non ho preso l'appunto)
1,5 µl di Primer (aliquote a 10 µm).
File
94 x 3' hot start
94x1 + 55x1 + 72x2 x 35 cicli
74x3: elongation finiale
10° x infinito
Appena ho caricato in TBE 2% ho aspettato che il loading buffer uscisse dai pozzetti un dieci minuti e ho controllato al transilluminatore: ho visto delle bande sfocate ma qualcosa ho visto... ho lasciato correre e quelle bande si son spiattellate su tutto il gel e praticamente non ho visto più nulla, se non il misero marker....
non so più dove sbattere la testa. quelli che mi seguono mi han detto che la contaminazione è da escludere perche:
1) altre pcr escono, persino di porzioni difficili da amplificare
2) stiamo lavorando da genomico
io ho proposto il consiglio datomi qui di Soda+SDS ma mi han detto che la soda andrebbe poi tamponata... devo cercare i manuali delle pipette per vedere se trovo qualche soluzione di decontaminazione scritta, ma non credo comunque mi permetterebbero di farla...
arrivato a sto punto non so più dove sbattere la testa... la Tm ho provato a giocarmela in tutti i modi, ma anche abbassando di 8 gradi rispetto a 60 (la temperatura a cui dovrebbero-e avevano- funzionato bene i primer) non ottengo niente
che si siano scassati i primer è quantomeno improbabile: la prima aliquota l'ho fatta dopo la risospensione, la seconda dopo 1 solo scongelamento...
che fare? |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2009 : 09:20:40
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Ciao
Quanto è lungo il tuo target?. Conosci il contenuto di GC? te lo chiedo perchè in entrambi i casi se è molto lungo e/o ha un gc content elevato (>60-65%)forse hai bisogno di ottimizzare la pcr (tempi di allungamento, t di denaturazione del DNA, aggiunta di enhancers etc.). Inoltre, 2.5 mM di Mgcl2 finali sono tanti per un pcr standard (a meno che, ripeto, non sia un templato difficile). Anche 300 ng di DNA a mio avviso sono tanti (in genere 50-100 ng vanno bene).
Ciao |
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PCR... non so dove sbattere la testa
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