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lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
 Inserito il - 19 giugno 2009 : 10:22:00
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Salve, avrei bisogno di un aiuto...se qualcuno sa rispondermi ne sarei molto grata...Ho fatto l'estrazione di DNA da sangue di diversi campioni. Poi ho amplificato un gene di interesse, il p2x7, e successivamente ho fatto l'RFLP per vedere se tali campioni presentavano mutazione in eterozigosi, omozigosi o se erano wilde type. Non ho avuto problemi di PCR, il controllo negativo è sempre venuto bene. Ultimamente ho iniziato a leggere allo spettrofotomentro il DNA per vedere quanto era e soprattutto se il rapporto dell'assorbanza a 260 e 280 era compreso fra 1.8 e 2. In realtà mi sono venuti dei rapporti brutti e le concentrazioni di DNA, nanogrammi su microlitro, molto bassi. Qualcuno sa mica spiegarmi il motivo? Vi ringrazio in anticipo, buona giornata!
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 10:48:40
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Ci potrebbero essere un'infinità di motivi.
Prima di tutto il rapporto è 280/260 e non il contrario.
Dipende poi dalla metodica di estrazione, prova a fare dei doppi passaggi di lavaggio (non so che cosa usi se kit o altro). Ma comunque se i risultati che ottieni sono buoni, non vedo perchè dovresti complicarti la vita. Pochi nanogrammi potrebbe essere dovuto a poco materiale di partenza, oppure troppo. Se ti serve una concentrazione più elevata potresti semplicemente risospendere il DNA con una quantità di buffer inferiore.
Con le poche info che hai dato non è che ti si possa aiutare più di tanto, magari metti il protocollo o kit che utilizzi così se qualcun'altro ne ha esperienza ti saprà consigliare meglio. |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 11:07:45
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Che cosa intendi per brutti?
Di solito se il rapporto viene più basso vuol dire che l'assorbanza a 280nm è maggiore e quindi hai una contaminazione da proteine o fenolo.
Hai provato a leggere a 230nm e a fare il rapporto 260/230? Dovrebbe essere compreso tra 2.0 e 2.2, anche questo è un indice della purezza del tuo campione perchè a 230nm assorbono sostanze come EDTA, carboidrati, ecc..
Poi, quanti microlitri di campione hai letto? a volte mi è capitato di leggere pochi microlitri e di avere un rapporto basso ma aumentando la quantità di DNA il rapporto è risultato essere migliore (però dipende dallo spettrofotometro che usi, quando usavo il nanodrop questo non mi è mai accaduto).
Citazione:
Ultimamente ho iniziato a leggere allo spettrofotomentro il DNA per vedere quanto era e soprattutto se il rapporto dell'assorbanza a 260 e 280 era compreso fra 1.8 e 2
Anche io sapevo che il rapporto doveva essere tra 1.8 e 2.0, ma ho letto da diverse parti e mi è stato confermato da uno specialist dell'Applied Biosystem che il rapporto 260/280 per il DNA deve essere tra 1.6 e 1.8 mentre per l'RNA tra 1.8 e 2.0 e questo a causa della presenza dell'uracile. Se qualcuno ha da dire qualcosa in proposito sono ben lieta di ascoltare
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 11:31:05
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Scusate sulla cavolata che ho scritto sul rapporto.
Ero sotto effetto del cloroformio...
Guarda per quanto riguarda il rapporto 260/230 è molto relativa la bontà, i miei campioni superano raramente 1, ma non ho mai avuto nessun tipo di problema. |
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lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 11:41:59
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Ciao, grazie per l'aiuto. Il kit che uso è il Nucleo Spin della Macherey Nagel. Mi sono sempre trovata bene per quanto riguarda l'estrazione di DNA dal tessuto e quindi l'ho ordinato anche per il sangue!Il protocollo prevede il trattamento di 200microlitri di sangue con 200microlitri di baffer di lisi, 25microlitri di Proteinasi K e incubazione a 70gradi per 15 minuti. Poi si aggiunge etanolo e si fa passare il tutto in colonnina. I due passaggi successivi sono di lavaggio con altri due buffer e infine l'eluizione nel buffer BE scaldato a 70 gradi. Io personalmente l'eluizione l'ho fatta in 50microlitri.
Per quanto riguarda i rapporti, intendo dire che variano molto: alcuni sono intorno a 1, altri addirittura arrivano a 3. Il mio spettrofotometro è quello classico con cuvetta ma ho fatto anche altre prove in un altro laboratorio con il nanodrop... |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 12:01:10
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Se usi BE per eluire ricordati di aggiungerlo anche per fare il bianco.
Purtroppo questo kit non l'ho mai usato e non ti posso essere di grande aiuto. Prova ad usare 100-150 microlitri di sangue. |
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lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2009 : 12:31:14
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| Certo, per fare il bianco uso il BE. Ti ringrazio per l'aiuto che mi hai dato. I dati che ho ottenuto con il nanodrop sono questi: campione 1, 14,6nanogrammi per microlitro e 260/280 1,54. Campione 2, 27,2nanogrammi/microlitro e rapporto 1,62. Cmpione 3, 23,45 nanogrammi/microlitro e rapporto 1,61 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2009 : 00:04:51
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Preferisco astenermi dai commenti su certi kit... le concentrazioni sono bassine, ma da 200ul di sangue non credo tu ottenga molto.
I rapporti non sono così drammatici, poi se comunque non hai problemi di amplificazione non mi preoccuperei troppo.
Confermo quanto detto sul rapporto 260/280, per DNA è tra 1,6 e 1,8.
Citazione:
Messaggio inserito da angemore
Anche io sapevo che il rapporto doveva essere tra 1.8 e 2.0, ma ho letto da diverse parti e mi è stato confermato da uno specialist dell'Applied Biosystem che il rapporto 260/280 per il DNA deve essere tra 1.6 e 1.8 mentre per l'RNA tra 1.8 e 2.0 e questo a causa della presenza dell'uracile. Se qualcuno ha da dire qualcosa in proposito sono ben lieta di ascoltare
Si è vero! I rapporti sono in realtà dati da una media dei rapporti calcolati per i singoli nucleotidi, l'uracile ha un rapporto 260/280 maggiore rispetto alla timina per questo il rapporto per l'RNA è maggiore.
I rapporti dei singoli nucleotidi sono:
Guanina: 1.15
Adenina: 4.50
Citosina: 1.51
Timina: 1.47
Uracile: 4.00
(i valori li ho presi dal manuale del Nanodrop che a sua volta li ha presi da: Leninger, A. L. Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, 1975)
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lora
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52 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2009 : 13:19:04
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| Grazie infinite per l'aiuto, da ora in avanti non farò più la lettura del DNA visto che la PCR non mi da problemi! |
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quantificazione DNA
Didattica e Relazioni
