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lora
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52 Messaggi

Inserito il - 22 giugno 2009 : 17:16:35

Salve; sono in difficoltà riguardo a dei risultati ottenuti dall'analisi RFLP. Il mio scopo è quello di vedere se i campioni presentano il polimorfismo A/C o C/C nel gene p2x7 in posizione 1513. Per l'analisi ho preso come riferimento un articolo, da cui ho ordinato l'enzima di restrizione e i primers. In seguito ho ordinato un'altra coppia di primers in quanto ho dovuto lavorare, oltre che su campioni di sangue, anche su campioni paraffinati.Ho quindi preso dei primers più corti. A questo punto non ho avuto nessun tipo di problema per l'amplificazione e nemmeno per la digestione, infatti nei vari campioni analizzati ho trovato le bande descritte dal lavoro. Facendo un'analisi più accurata mi sono accorta però che l'enzima taglia in due punti lontani dal sito del polimorfismo e addirittura fuori dalla regione amplificata dai miei primers. Come è possibile che mi vengano i frammenti giusti descritti dall'articolo?Qualcuno saprebbe darmi dei sugerimenti?Ringrazio in anticipo chiunque è in grado di aiutarmi. PS: inserisco la sequenza con il polimorfismo e i primers di interesse

1201 CCCTGGTGCAAGTGCTGTCAGCCCTGTGTGGTCAACGAATACTACTACAGGAAGAAGTGC
1261 GAGTCCATTGTGGAGCCAAAGCCGACATTAAAGTATGTGTCCTTTGTGGATGAATCCCAC
1321 ATTAGGATGGTGAACCAGCAGCTACTAGGGAGAAGTCTGCAAGATGTCAAGGGCCAAGAA
1381 GTCCCAAGACCTGCGATGGACTTCACAGATTTGTCCAGGCTGCCCCTGGCCCTCCATGAC
1441 ACACCCCCGATTCCTGGACAACCAGAGGAGATACAGCTGCTTAGAAAGGAGGCGACTCCT
1501 AGATCCAGGGATAGCCCCGTCTGGTGCCAGTGTGGAAGCTGCCTCCCATCTCAACTCCCT pol pos 1513
1561 GAGAGCCACAGGTGCCTGGAGGAGCTGTGCTGCCGGAAAAAGCCGGGGGCCTGCATCACC
1621 ACCTCAGAGCTGTTCAGGAAGCTGGTCCTGTCCAGACACGTCCTGCAGTTCCTCCTGCTC
1681 TACCAGGAGCCCTTGCTGGCGCTGGATGTGGATTCCACCAACAGCCGGCTGCGGCACTGT
1741 GCCTACAGGTGCTACGCCACCTGGCGCTTCGGCTCCCAGGACATGGCTGACTTTGCCAAC
1801 CTGCCCAGCTGCTGCCGCTGGAGGATCCGGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGAAGGGCAGTAC
1861 AGTGGCTTCAAGAGTCCTTACTGA

TTCCTGGACAACCAGAGGAG

AGACACGTCCTGCAGTTCCT

Questi sono i primers scelti da me mantre questi

GACTCCTAGATCCAGGGATAGCC

GGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGA sono quelli suggeruti dal lavoro

Il polimorfismo è la A evidenziata e le due sequenze riconosciute dall’enzima HhaI sono 5’ GCGC 3’

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 22 giugno 2009 : 18:58:29

Devo dire che ci ho messo un po' a risolvere il mistero, risalire alla sequenza ai vari lavori ecc...
comunque mistero svelato!

Hai sbagliato a segnare la posizione in cui c'è il polimorfismo!
Quella corretta te la evidenzio qua sotto:

1201 CCCTGGTGCAAGTGCTGTCAGCCCTGTGTGGTCAACGAATACTACTACAGGAAGAAGTGC
1261 GAGTCCATTGTGGAGCCAAAGCCGACATTAAAGTATGTGTCCTTTGTGGATGAATCCCAC
1321 ATTAGGATGGTGAACCAGCAGCTACTAGGGAGAAGTCTGCAAGATGTCAAGGGCCAAGAA
1381 GTCCCAAGACCTGCGATGGACTTCACAGATTTGTCCAGGCTGCCCCTGGCCCTCCATGAC
1441 ACACCCCCGATTCCTGGACAACCAGAGGAGATACAGCTGCTTAGAAAGGAGGCGACTCCT
1501 AGATCCAGGGATAGCCCCGTCTGGTGCCAGTGTGGAAGCTGCCTCCCATCTCAACTCCCT ~~pol pos 1513~~
1561 GAGAGCCACAGGTGCCTGGAGGAGCTGTGCTGCCGGAAAAAGCCGGGGGCCTGCATCACC pol pos 1513
1621 ACCTCAGAGCTGTTCAGGAAGCTGGTCCTGTCCAGACACGTCCTGCAGTTCCTCCTGCTC
1681 TACCAGGAGCCCTTGCTGGCGCTGGATGTGGATTCCACCAACAGCCGGCTGCGGCACTGT
1741 GCCTACAGGTGCTACGCCACCTGGCGCTTCGGCTCCCAGGACATGGCTGACTTTGCCAAC
1801 CTGCCCAGCTGCTGCCGCTGGAGGATCCGGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGAAGGGCAGTAC
1861 AGTGGCTTCAAGAGTCCTTACTGA

sinceramente non mi sono messa a guardare bene la sequenza in database e a vedere da dove inizia realmente.
Comunque da altri lavori su questo polimorfismo (quello che hai indicato tu non l'ho trovato) ho trovato che la posizione giusta è quella!
Se hai la sequenza come da database con la A non hai il sito di restrizione (GAGC), ma se hai la C allora ti salta fuori il sito di restrizione per HhaI (GCGC).
Prova a ricontrollare se così ti tornano i conti!

lora
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 23 giugno 2009 : 13:13:19

Non so davvero come fare a ringraziarti. Sono contenta del tuo aiuto, ora si spiega tutto, anzi i primer più corti per il paraffinato sembrano essere migliori rispetto agli altri. Ti auguro una buona giornata!